| Produção, purificação e caracterização bioquímica de pectinases de Aspergillus japonicus e Thermoascus aurantiacus: aplicação da enzima de A. japonicus na clarificação de sucos de frutas |
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| Curso |
Doutorado em Bioquímica e Biologia Molecular |
| Tipo |
Tese |
| Data |
10/03/2023 |
| Área |
BIOLOGIA GERAL |
| Orientador(es) |
- Giovana Cristina Giannesi
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| Orientando(s) |
- Nelciéle Cavalieri de Alencar Guimarães
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| Banca |
- Edson dos Anjos dos Santos
- Giovana Cristina Giannesi
- Karina Marcia Ribeiro de Souza Nascimento
- MARINA KIMIKO KADOWAKI
- Rodrigo Simões Ribeiro Leite
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| Resumo |
O desenvolvimento de alternativas inovadoras e sustentáveis para agregar valor aos resíduos de biomassa lignocelulósica provenientes de fontes agrícolas e alimentares é necessário no mundo todo. A biomassa lignocelulósica é uma fonte de recursos renováveis por ser uma matéria orgânica constituída de uma complexa matriz de polissacarídeos, incluindo celulose, hemicelulose e pectina. As pectinases são um grupo complexo de enzimas que degradam substâncias pécticas e são muito utilizadas pelas indústrias. Estas são usadas principalmente na indústria alimentícia, como nas indústrias de sucos de frutas, onde seu uso aumenta o rendimento e a qualidade do produto final. Neste contexto, o objetivo geral foi estudar a produção de pectinases pelos fungos Aspergillus japonicus e Thermoascus aurantiacus usando substratos de baixo custo e analisar as suas aplicações na clarificação de sucos de frutas. A melhor produção de pectinase por T. aurantiacus foi em SSC com farinha de mandioca de Rondonópolis/MT com 26,7 U/g de substrato seco (ou 2,67 U/mL). E para A. japonicus foi observado que a maior produção de pectinase foi com casca de maracujá em SSC (30 U/g de substrato seco ou 3 U/mL). Para T. aurantiacus, 96 h de crescimento foi o melhor tempo, enquanto para A. japonicus foi 48 h. Na avaliação dos efeitos do pH e temperatura para atividade das enzimas, T. aurantiacus teve pH 4,0 e 70 °C como parâmetros ótimos, e A. japonicus pH 4,0 e 60 °C. Na avaliação da estabilidade, a pectinase de A. japonicus (extrato bruto) ficou totalmente estável durante 4 h em todos os pHs testados. Sobre termoestabilidade, a pectinase de A. japonicus se manteve estável durante 6 h a 25 °C, e após as 24 h de teste ainda manteve 74% da atividade inicial. A 50 ºC a enzima manteve 71% de atividade durante 6 h. A pectinase (extrato bruto) de A. japonicus foi avaliada na clarificação de 13 polpas e foi superior à pectinase comercial (Pectinex) em todas as frutas avaliadas. A melhor clarificação obtida usando 3 U/mL da pectinase (extrato bruto) de A. japonicus foi em manga (Haden) com 85,56%, enquanto a Pectinex clarificou apenas 50,89%. Com a maçã (Argentina), a pectinase de A. japonicus foi 5 vezes mais eficiente na clarificação do que a Pectinex, com 66,32% e 12,67% de clarificação, respectivamente. A pectinase de T. aurantiacus foi purificada em duas etapas cromatográficas (DEAE-fractogel e sephacryl S-200), com atividade específica de 75,7 U/mg proteína, resultando em um fator de purificação de 10 vezes com 21% de rendimento. E a pectinase de A. japonicus também foi semi-purificada em duas etapas cromatográficas (DEAE-fractogel e fenil-sepharose), resultando em uma purificação de 2,9 vezes com 81% de rendimento e uma atividade específica de 7,9 U/mg de proteína, exibindo um peso molecular de cerca de 40 kDa (nomeada como PGAj). Na espectrometria de massas (LC-MS/MS) de PGAj uma poligalacturonase de 29,99 kDa foi a mais abundante. O pH e a temperatura ótimos para a atividade da PGAj foram pH 4,0 e 55 °C, respectivamente. Além disso, a enzima PGAj reteve acima de 90% da sua atividade inicial por 4 h em pH 4,0, 5,0 e 6,0. A enzima manteve 83% de atividade residual após 20 min a 50 °C. No teste de especificidade, A PGAj teve a pectina cítrica como substrato preferido, seguida de pectina de maçã e ácido poligalacturônico. Para os testes de clarificação de sucos pela PGAj também foram usadas 13 polpas, onde o melhor resultado obtido foi com as polpas de manga (Palmer e Tommy), com 65% e 41%, enquanto a Pectinex clarificou apenas 49% e 21%, respectivamente. Em seguida a goiaba branca, a banana nanica e a maçã gala, tiveram 40%, 11% e 9,4% de clarificação, respectivamente. O melhor resultado obtido na imobilização foi com alginato de sódio 2%, usando 0,1 M de CaCl2. Nos testes de reuso a PGAj imobilizada manteve 100% de atividade após 6 ciclos de reação usando pectina 1% como substrato. Conclui-se que a pectinase (extrato bruto) e a semi-purificada de A. japonicus mostraram potencial para aplicação em indústrias de bebidas, para contribuir com uma produção eficiente e econômica de sucos de frutas mais claros. |
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| Caracterização dos efeitos inflamatórios induzidos pela peçonha da vespa Parachartergus fraternus – estudos in vivo e in vitro |
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| Curso |
Doutorado em Bioquímica e Biologia Molecular |
| Tipo |
Tese |
| Data |
05/03/2021 |
| Área |
BIOLOGIA GERAL |
| Orientador(es) |
- Monica Cristina Toffoli Kadri
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| Orientando(s) |
- Jéssica de Araujo Isaias Muller
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| Banca |
- Alda Maria Teixeira Ferreira
- Malson Neilson de Lucena
- Maria Ligia Rodrigues Macedo
- Monica Cristina Toffoli Kadri
- Saulo Euclides Silva Filho
- Susana Elisa Moreno
- Vanessa Moreira
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| Resumo |
A peçonha das vespas possui compostos que podem desencadear diferentes reações nas
vítimas, sendo uma delas a inflamatória. Por outro lado, esses mesmos compostos, quando
isolados, podem ser úteis como potenciais ferramentas terapêuticas. Dentre as espécies de
vespa, está a Parachartergus fraternus, endêmica na América Latina. Estudos recentes
mostraram que a peçonha dessa vespa foi capaz de induzir edema em camundongos e que
peptídeos isolados da peçonha tiveram ação antinociceptiva. No entanto, o envolvimento da
peçonha em diferentes aspectos da reação inflamatória, mecanismos e participação dos
compostos isolados não foram investigados. O objetivo do presente trabalho foi caracterizar in
vivo e in vitro o processo inflamatório induzido pela peçonha de P. fraternus (pPf) e o
potencial antimicrobiano e citotóxico de peptídeos isolados e derivados da pPf. Para os
ensaios in vivo foram utilizados camundongos Swiss machos (n=7/grupo,18-25g) e a pPf nas
doses de 100, 200 e 400 μg/kg. Nos ensaios in vitro foram utilizados macrófagos peritoneais
de camundongos e a pPf nas concentrações de 2,5, 5 e 10 μg/mL. A avaliação dos peptídeos
utilizou concentrações de 0.03 μM a 50 μM, de acordo com cada ensaio. Os resultados foram
expressos como média±EPM; ANOVA; Bonferroni; p<0,05. Nos ensaios in vivo foi
observado que a pPf desencadeou edema na pata de camundongos com pico na dose de 200
μg/kg, aos 10 min. Os tratamentos com os fármacos dexametasona, indometacina, celecoxibe,
MK886, loratadina, cimetidina, cipro-heptadina, captopril e L-NAME reduziram esse evento.
A pPf também aumentou a permeabilidade vascular em todas as doses e no período entre 15 e
60 min. A pPf (200 μg/kg) induziu a desgranulação dos mastócitos em todos os períodos
sendo o pico, aos 15 min. Essa mesma dose induziu o influxo leucocitário para a cavidade
peritoneal de camundongos com predomínio de células mononucleares em todos os períodos.
O aumento da expressão do mRNA para COX-2, iNOS e IFN-γ ocorreu 1 e 6h após a injeção
da pPf. Também foi detectado o aumento na expressão de IL-10, 48h após a injeção. A análise
histopatológica mostrou infiltração acentuada de macrófagos e mastócitos na região da pele
dos animais em que foi injetada a peçonha. Nos ensaios in vitro a pPf não foi citotóxica no
ensaio de MTT e não causou o descolamento de macrófagos em placas de cultura celular.
Porém, aumentou a adesão de macrófagos, espraiamento e fagocitose, bem como induziu a
liberação de peróxido de hidrogênio e óxido nítrico. Adicionalmente, os ensaios de dicroísmo
circular e RMN realizados com os peptídeos isolados (agelaia-MPI e protonectina) e
derivados da pPf (neuroVAL e protonectina-F) indicaram a presença da estrutura em a-hélice
utilizando o solvente TFE 30%. Todos os peptídeos apresentaram atividade antimicrobiana e
antitumoral, com exceção do neuroVAL. A agelaia-MPI foi o único peptídeo hemolítico.
Todos os peptídeos internalizaram células normais e tumorais, sendo que a protonectina e a
protonectina-F acumulam em ambos os tipos celulares. Em conclusão, a pPf induziu processo
inflamatório causando alterações vasculares e celulares in vivo e ativando macrófagos in vitro.
Ainda, os peptídeos isolados e derivados da pPf tem potencial farmacológico, principalmente
o neuroVAL que pode ser utilizado como peptídeo de penetração celular e a protonectina e
protonectina-F como antimicrobiano e antitumoral. |
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| EFEITO MODULATÓRIO DA MELATONINA SOBRE O ESTRESSE OXIDATIVO E VISCOSIDADE DE AMOSTRAS DE MUCO CERVICAL INFECTADAS PELO PAPILOMAVÍRUS HUMANO |
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| Curso |
Doutorado em Bioquímica e Biologia Molecular |
| Tipo |
Tese |
| Data |
08/12/2020 |
| Área |
BIOLOGIA GERAL |
| Orientador(es) |
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| Orientando(s) |
- Aron Carlos de Melo Cotrim
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| Banca |
- Alda Maria Teixeira Ferreira
- Aníbal Monteiro de Magalhães Neto
- Cacilda Tezelli Junqueira Padovani
- Ines Aparecida Tozetti
- Jeandre Augusto dos Santos Jaques
- Ludier Kesser Santos Silva
- Marco Antonio Moreira Puga
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| Resumo |
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| Efeito de extratos vegetais da flora sul-mato-grossense sobre Trypanosoma cruzi |
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| Curso |
Doutorado em Bioquímica e Biologia Molecular |
| Tipo |
Tese |
| Data |
10/03/2020 |
| Área |
BIOLOGIA GERAL |
| Orientador(es) |
- Alda Maria Teixeira Ferreira
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| Orientando(s) |
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| Banca |
- Alda Maria Teixeira Ferreira
- Alessandra Gutierrez de Oliveira
- Camila Mareti Bonin Jacob
- Carlos Eurico dos Santos Fernandes
- Denise Brentan da Silva
- Lia Carolina Soares Medeiros
- Renata Trentin Perdomo
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| Resumo |
O Trypanosoma cruzi é um protozoário flagelado, agente etiológico da doença de
Chagas. No Brasil, estima-se que mais de um milhão de pessoas sofram com esta moléstia,
que ainda é um problema sério de saúde pública, afetando desproporcionalmente as
populações de baixa renda. Os medicamentos atualmente utilizados são pouco eficazes na
fase crônica da doença e apresentam uma série de efeitos colaterais, incluindo efeitos
mutagênico e carcinogênico. Como alternativa terapêutica, este estudo propôs a pesquisa por
compostos biologicamente ativos, provenientes de diversas espécies do Cerrado Sul-Mato-
Grossense, por meio da avaliação de extratos vegetais, frações e seus compostos isolados
frente ao parasita T. cruzi (Dm28c). A metodologia proposta envolveu três etapas,
inicialmente ensaios biológicos de triagem contra formas epimastigotas de T. cruzi, e a partir
dos extratos ativos a identificação dos constituintes majoritários e a avaliação de suas frações
e subfrações. A segunda etapa envolveu a avaliação dos compostos isolados frente
epimastigotas, e dos compostos considerados ativos, a avaliação frente ensaios de
recuperação e da curva de crescimento de epimastigotas tratados. Esta etapa contou também
com avaliação dos compostos selecionados sobre a interferência no processo de
metaciclogênese in vitro, sua citotoxicidade em células Vero e suas atividades sobre outras
formas do parasita. Compostos considerados tripanocidas e com altos valores de índice de
seletividade (IS) foram utilizados na terceira etapa do estudo, que buscou a determinação do
mecanismo de morte celular desencadeado nas formas epimastigotas do T. cruzi. Na primeira
etapa do estudo foram avaliados 135 extratos vegetais de 88 espécies de plantas, dos quais
27 extratos, pertencentes a 18 espécies foram considerados ativos frente às formas
epimastigotas. Das 52 frações testadas, foram avaliados 24 compostos isolados, dos quais
10 apresentaram atividade frente a epimastigotas, sendo alguns ativos também frente
amastigotas e tripomastigotas. Deste estudo destacaram-se 2 lactonas, 1 stirilpirona e 2
sesquiterpenos com resultados em diversas formas e bons índices de seletividade. Da lactona
considerada o composto mais promissor, observou-se diversos eventos celulares que
indicam o disparo da morte celular por necrose dos parasitas. Este mesmo composto
demonstrou causar desequilíbrio energético em menores concentrações e acúmulo de
lipídios no citoplasma dos parasitas. Estes dados indicam o potencial farmacológico de
diversos compostos de origem vegetal contra o T. cruzi e que serão alvo de futuros estudos
por nosso grupo de pesquisa. |
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| Estudos bioquímicos e funcionais de um inibidor de serinopeptidases do tipo Kunitz purificado de sementes de Inga vera |
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| Curso |
Doutorado em Bioquímica e Biologia Molecular |
| Tipo |
Tese |
| Data |
24/09/2018 |
| Área |
BIOLOGIA GERAL |
| Orientador(es) |
- Maria Ligia Rodrigues Macedo
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| Orientando(s) |
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| Banca |
- Alda Maria Teixeira Ferreira
- Caio Fernando Ramalho de Oliveira
- Edgar Julian Paredes Gamero
- Fabiana Fonseca Zanoelo
- Giovana Cristina Giannesi
- Maria Ligia Rodrigues Macedo
- Simone Maria Neto
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| Resumo |
Inibidores de peptidase de plantas exibem atividades biológicas que têm atraído interesse para agricultura e ciências da saúde. Neste trabalho, são descritas a purificação, as propriedades bioquímicas e biológicas de um inibidor de tripsina de sementes de Inga vera (IVTI). A sequência parcial de aminoácidos do IVTI revelou homologia à família dos inibidores Kunitz MEROPS I03. IVTI é composto de uma única cadeia polipeptídica de 20 kDa com apenas uma ponte dissulfeto, sendo capaz de inibir a tripsina bovina na proporção molar de 1: 1 com uma constante de inibição de 1,15 nM. O IVTI foi estável a uma ampla faixa de temperatura, pH e concentrações de um agente redutor. Além disso, IVTI foi fungicida contra Candida buinensis (0,125 mg/mL) e bacteriostático contra Escherichia coli (0,5 mg/mL). Outros ensaios revelaram que IVTI é um agente quimiopreventivo contra células de adenocarcinoma colorretal epitelial humano (CACO-2), reduzindo a viabilidade celular em 70% a 200 µg/mL e não apresentou citotoxicidade contra células normais. Bioensaios contra Spodoptera frugiperda demonstraram que o IVTI afetou o desenvolvimento larval por prejudicar o ganho de peso e sobrevivência, bem como prorrogar a duração do ciclo larval. Os parâmetros nutricionais mostraram que uma maior quantidade de alimento foi convertida em gasto energético metabólico, em vez de ganho de massa corporal. Além disso, a ingestão crônica de IVTI inibiu a maior parte da atividade da tripsina e quimotripsina do inseto, embora a análise de expressão gênica tenha revelado um aumento na transcrição de três genes tripsinas e quatro quimotripsinas, como resposta compensatória do inseto. Larvas alimentadas com IVTI excretaram altos níveis de tripsina e quimotripsina nas fezes, bem como IVTI, que ainda permaneceu com sua atividade inibitória preservada. A resistência do IVTI à hidrólise por peptidases do intestino médio de insetos manteve sua atividade inibitória. A inibição das enzimas bloqueou a digestão de proteínas que provocou efeitos antinutricionais às larvas. Dessa maneira, estes resultados demonstram o potencial multifuncional do IVTI como uma ferramenta biotecnológica para a agricultura e saúde. |
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| Efeito de uma proteína de reserva vegetal no desenvolvimento da lagarta-do-cartucho Spodoptera frugiperda: uma abordagem bioquímica e molecular do mecanismo entomotóxico |
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| Curso |
Doutorado em Bioquímica e Biologia Molecular |
| Tipo |
Tese |
| Data |
21/09/2018 |
| Área |
BIOLOGIA GERAL |
| Orientador(es) |
- Maria Ligia Rodrigues Macedo
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| Orientando(s) |
- Carolina Turatti Oliveira
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| Banca |
- Alda Maria Teixeira Ferreira
- Edgar Julian Paredes Gamero
- Fabiana Fonseca Zanoelo
- Giovana Cristina Giannesi
- Maria Ligia Rodrigues Macedo
- Simone Maria Neto
- Suzy Wider Machado
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| Resumo |
Talisin é uma proteína de reserva de sementes de Talisia esculenta que apresenta tanto propriedades de lectinas quanto de inibidores de peptidases. Tais características sugerem que Talisin desempenha um papel no processo de defesa da planta, fato este que torna Talisin uma proteína multifuncional. Este trabalho buscou investigar os efeitos da ingestão crônica de Talisin em larvas de quinto instar de Spodoptera frugiperda, considerado o principal inseto praga do milho e causador de vultosos prejuízos econômicos em diversas outras culturas agrícolas. A ingestão crônica de Talisin acarretou efeitos antinutricionais nas larvas, reduzindo o peso e prolongando o tempo de desenvolvimento total dos insetos. Além disso, larvas alimentadas com Talisin também apresentaram redução significativa da atividade de enzimas do tipo tripsinas. Análises histológicas do intestino médio de larvas alimentadas com Talisin mostrou alterações no epitélio intestinal e ruptura da membrana peritrófica, o que possivelmente causou um aumento da atividade de aminopeptidase no lúmen intestinal. Talisin também se mostrou resistente a degradação pelas enzimas digestivas de S. frugiperda. O perfil de transcrição de genes de tripsinas, quimotripsinas e aminopeptidases foi analisado em qPCR. A ingestão de Talisin ocasionou a expressão diferencial de pelo menos dois genes de cada uma dessas classes de enzimas. Estudos de docking molecular indicaram haver uma maior afinidade de Talisin com as enzimas menos expressas. |
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| Seleção de fungos filamentosos para produção de ácidos graxos poli-insaturados(PUFAS) a partir de glicerol de biodiesel |
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| Curso |
Doutorado em Bioquímica e Biologia Molecular |
| Tipo |
Artigo Científico |
| Data |
08/06/2018 |
| Área |
BIOLOGIA GERAL |
| Orientador(es) |
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| Orientando(s) |
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| Banca |
- Denis Pires de Lima
- Edson dos Anjos dos Santos
- Fabiana Fonseca Zanoelo
- Maria Rita Marques
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| Resumo |
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