Mestrado em Bioquímica e Biologia Molecular

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DESENHO DE UM NOVO PEPTÍDEO ANTIMICROBIANO ULTRACURTO GUIADO POR FERRAMENTAS COMPUTACIONAIS
Curso Mestrado em Bioquímica e Biologia Molecular
Tipo Dissertação
Data 28/03/2022
Área BIOLOGIA GERAL
Orientador(es)
  • Maria Ligia Rodrigues Macedo
Coorientador(es)
    Orientando(s)
    • MARIA CAROLINE DE MOURA CAVALHEIRO
    Banca
    • Caio Fernando Ramalho de Oliveira
    • Fabiana Fonseca Zanoelo
    • Malson Neilson de Lucena
    • Maria Ligia Rodrigues Macedo
    • Marlon Henrique e Silva Cardoso
    Resumo Os peptídeos antimicrobianos possuem sítios de ação diferente dos antibióticos convencionais. Pesquisas recentes têm buscado por peptídeos capazes de controlar bactérias multirresistentes, sem apresentar efeitos colaterais contra células saudáveis. Neste trabalho descrevemos as propriedades antimicrobianas do RK8, um peptídeo ultracurto, que possui 8 resíduos de aminoácidos. As características físico-químicas do RK8 foram projetadas previamente através de ferramentas computacionais. A estrutura secundária de RK8 foi determinada na presença de água e condições que mimetizam as membranas biológicas por dicroísmo circular (CD). O peptídeo foi testado contra cepas de bactérias multirresistentes Gram-negativas e Gram-positivas. O efeito sinérgico de RK8 e ciprofloxacino foi avaliado contra Escherichia coli KPC+ e Acinetobacter baumannii multirresistente. A capacidade de erradicar biofilmes maduros multirresistentes de A. baumannii também foi avaliada. Ensaios de citotoxicidade in vitro e in vivo foram realizados. A estabilidade do RK8 contra peptidases foi investigada ‘em solução de soro fetal bovino a 25% e seu mecanismo de ação sobre a membrana microbiana avaliada através da a captação do intercalante de DNA Sytox green. Análises de CD mostraram que o RK8 assumiu uma estrutura não-ordenada em água e dodecil sulfato de sódio (SDS), sugerindo que mesmo sendo originalmente desenhado para assumir uma estrutura secundária do tipo alfa-hélice, devido ao seu tamanho reduzido, o peptídeo atua sobre membranas com uma estrutura estendida. O peptídeo apresentou uma concentração inibitória mínima (CIM) contra MRSA ATCC33591 e ATCC43300 de 8 e 16 µM, respectivamente. Para E. coli KPC+ e A. baumannii, RK8 apresentou uma CIM de 16 e 64 µM, respectivamente. A combinação de RK8 e o ciprofloxacino apresentou efeito sinérgico contra E. coli KPC+, reduzindo em 32 vezes e 8 vezes a concentração do antibiótico e do peptídeo, respectivamente, para exercer efeitos antimicrobianos. O RK8 foi capaz de erradicar 38% do biofilme maduro de A. baumannii, quando utilizado na CIM ou na metade dela, afetando a estrutura do biofilme e a viabilidade bacteriana. O RK8 não apresentou efeitos citotóxicos contra macrófagos murinos (até 64 µM) ou contra eritrócitos (até 100 µM) ou contra larvas de Galleria mellanella (até 960 µM). No ensaio de estabilidade contra peptidases, o RK8 se mostrou estável, mantendo cerca de 60% da molécula íntegra após 120 min de incubação. Neste mesmo tempo de ensaio, o reagente Sytox Green alcançou 100% de permeação de membrana de bactérias Gram-positivas e Gram-negativas. Em resumo, RK8 representa uma estratégia promissora para o desenvolvimento de um novo agente antimicrobiano e antibiofilme contra bactérias multirresistentes.
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      Estudo de reposicionamento de fármacos com potencial atividade contra enzimas do metabolismo de Trypanosoma cruzi
      Curso Mestrado em Bioquímica e Biologia Molecular
      Tipo Dissertação
      Data 25/03/2022
      Área BIOLOGIA GERAL
      Orientador(es)
      • Alda Maria Teixeira Ferreira
      Coorientador(es)
        Orientando(s)
        • Caroline Silva Garcia
        Banca
        • Alda Maria Teixeira Ferreira
        • Carla Cardozo Pinto de Arruda
        • Carla Leticia Gediel Rivero Wendt
        • Malson Neilson de Lucena
        • Renata Trentin Perdomo
        Resumo Trypanosoma cruzi, é o agente etiológico da doença de Chagas, uma das principais doenças de saúde pública de interesse na América Latina. Os fármacos disponíveis para o tratamento dessa doença (benznidazol e nifurtimox) apresentam maior eficácia na fase aguda, porém são relatados inúmeros casos de efeitos adversos. Nesse panorama, o reposicionamento de fármacos tem se tornado uma estratégia importante por ser uma alternativa mais rápida e menos onerosa do que a descoberta e o desenvolvimento de novos fármacos. Este trabalho teve como objetivo a seleção in silico de fármacos já aprovados para uso clínico em humanos com potencial atividade contra T. cruzi cepa Dm28.Foram utilizadas bases de dados on-line e gratuitas para a busca e seleção de drogas com potencial ação sobre enzimas homólogas dos metabolismos energético e lipídico do T. cruzi, com base na identificação de alvos de drogas com alta similaridade aos genes de patógenos. Na base de dados TDR Targets foram identificados 139 e 151 genes codificadores de enzimas do metabolismo energético e do metabolismo lipídico de T. cruzi, respectivamente. Posteriormente, obteve-se a sequência aminoacídica das enzimas citadas na base de dados TriTrypDB. As sequências foram inseridas nos bancos de dados DrugBank e no Therapeutic Targets para identificação de alvos de drogas homólogos. Dentre as sequências proteicas com resultados positivos, foram incluídas somente aquelas com E-value<1e-10. As sequências incluídas apresentaram correspondência com 265 fármacos para o metabolismo energético e 387 para o lipídico. Dessas, 56 e 42, respectivamente, eram drogas já aprovadas para o uso em humanos. Em seguida, foi realizada a seleção dos fármacos cuja atividade anti-T. cruzi Dm28c não havia sido previamente reportada, utilizando os bancos de dados PUBMED, LILACS e Google Acadêmico, resultando em 19 fármacos para o metabolismo energético e 25 para o lipídico. Dos 44 fármacos identificados no estudo como potenciais agentes anti-T. cruzi, 7 foram submetidos a testes in vitro. Dentre os fármacos testados, o nitrato de oxiconazol e o lansoprazol se mostraram ativos contra formas epimastigotas de T. cruzi, entretanto, apenas o segundo teve atividade contra formas tripomastigotas do parasito. Além disso, a estratégia in silico de reposicionamento de fármacos utilizada neste trabalho elencou mais 37 fármacos, ainda não submetidos a testes in vitro, com potencial ação anti-T. cruzi.

        Palavras-chave: Doença de Chagas, Trypanosoma cruzi, Reposicionamento de Fármacos, In Silico
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          Caracterização bioquímica e biológica da peçonha e hemolinfa de Tityus paraguayensis
          Curso Mestrado em Bioquímica e Biologia Molecular
          Tipo Dissertação
          Data 03/03/2022
          Área BIOLOGIA GERAL
          Orientador(es)
          • Malson Neilson de Lucena
          Coorientador(es)
            Orientando(s)
            • Henrique Ranieri Covali Pontes
            Banca
            • Fabiana Fonseca Zanoelo
            • Ludovico Migliolo
            • Malson Neilson de Lucena
            • Monica Cristina Toffoli Kadri
            • Renata dos Santos Rodrigues
            Resumo Os escorpiões são artrópodes pertencentes a ordem Scorpiones, com aproximadamente 2654 espécies descritas e distribuídas por diversos ecossistemas, sendo muitas destas endêmicas. Estes animais apresentam hemolinfa e glândulas de peçonha, contendo a peçonha que pode ser inoculada na presa pelo télson. Portanto, os escorpiões são animais peçonhentos, embora cerca de 50 espécies apresentem importância médica. Tanto a hemolinfa, quanto a peçonha apresentam componentes com diversas funções bioquímicas e biológicas, entre essas algumas de interesse farmacológico e/ou biotecnológico. Visto isso, o presente estudo teve como objetivo caracterizar bioquímica e biologicamente a peçonha e hemolinfa do escorpião endêmico de Mato Grosso do Sul, T. paraguayensis. Para este fim, foram realizadas as seguintes etapas: ensaios eletroforéticos; atividades proteolíticas, fosfolipásicas A2, lipolíticas e antitríptica; atividade antitripanossômica; avaliação da citotoxicidade; efeito da peçonha e hemolinfa sobre a atividade (Na+,K+)-ATPase; e obtenção de perfil cromatográfico. Observou-se nos ensaios eletroforéticos e cromatográficos que a peçonha apresenta uma grande diversidade de componentes, também se detectou atividade proteolítica, fosfolipásica e lipolítica, ademais a peçonha provocou um aumento de atividade da enzima (Na+,K+)-ATPase e uma diminuição da viabilidade de formas epimastigota de T. cruzi. Não foram observadas citotoxicidade contra células normais e atividade antitríptica da peçonha de T. paraguayensis. A hemolinfa por sua vez, apresentou baixa diversidade de proteínas, além da presença de atividades proteolítica e lipolítica. Os resultados demonstram que a peçonha e hemolinfa de T. paraguayensis apresentam potencial para bioprospecção de compostos de interesse farmacológico e/ou biotecnológicos, necessitando de novos estudos para caracterizar e isolar estes componentes.
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            ATIVIDADES BACTERICIDAS E ANTICANCERÍGENAS DO INIBIDOR DE TRIPSINA PURIFICADO DE SEMENTES DE Enterolobium timbouva
            Curso Mestrado em Bioquímica e Biologia Molecular
            Tipo Dissertação
            Data 20/12/2021
            Área BIOLOGIA GERAL
            Orientador(es)
            • Maria Ligia Rodrigues Macedo
            Coorientador(es)
              Orientando(s)
              • PAULA BÊLIT MAZACOTE ZENTENO
              Banca
              • Eduardo Benedetti Parisotto
              • Fabiana Fonseca Zanoelo
              • Josy Goldoni Lazarini
              • Maria Ligia Rodrigues Macedo
              • Rita de Cassia Avellaneda Guimaraes
              Resumo Um dos problemas enfrentados mundialmente é a resistência microbiana. Nesse contexto, inibidores de peptidases vegetais que têm potencial atividade antimicrobianos e também podem servir como modelo para o desenho de novos fármacos, capazes de induzir morte. Nesse trabalho objetivou-se isolar e purificar um inibidor de tripsina das sementes de Enterolobium timbouva (EtTI), além de verificar suas atividades bactericidas e antitumorais. O EtTI foi purificado em duas etapas cromatográficas. A eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) com dodecil- sulfato de sódio (SDS) revelou que EtTI possui um peso molecular aproximado de 19 kDa. O EtTI apresentou concentração inibitória mínima (CIM) para espécies de bactérias Gram-positivas: Staphylococcus epidermidis (9µM), Staphylococcus haemolyticus (9µM) e Staphylococcus saprophyticus (4.5µM) e Gram-negativa: Escherichia coli (9µM). Ao fazer o tratamento com CIM e 10 vezes o valor de CIM obtivemos os resultados para biofilmes: redução na formação do biofilme e no biofilme maduro para a cepa S. saprophyticus. Imagens representativas de ensaio com biofilme, foram obtidas por microscopia de fluorescência. No ensaio com Sytox Green - permeável em células com membranas danificadas – tivemos uma permeação 48% em 2 horas, indicando possível mecanismo por dano de membrana. Além disso, EtTI mostrou efeito sinérgico com o antibiótico Vancomicina. Na avaliação de atividade anticâncer, o inibidor apresentou um IC50 de 2,69µM em células de melanoma murino. Em teste in vivo, através de modelo invertebrado Galleria mellonela, EtTI não apresentou toxicidade aguda nas concentrações estudadas. A atividade biológica de EtTI demostra potencial antimicrobiano e, a partir da elucidação da sequência do EtTI, peptídeos antimicrobianos podem ser desenhados a fim de se obter potenciais moléculas com aplicação clínica.
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                PERFIL DE CITOCINAS EM PACIENTES COM CERVICITE, LESÕES CERVICAIS OU CARCINOMA CERVICAL
                Curso Mestrado em Bioquímica e Biologia Molecular
                Tipo Dissertação
                Data 09/12/2021
                Área BIOLOGIA GERAL
                Orientador(es)
                • Ines Aparecida Tozetti
                Coorientador(es)
                  Orientando(s)
                  • Mariana Mayumi Tadokoro
                  Banca
                  • Alda Maria Teixeira Ferreira
                  • GISELE FACHOLI BOMFIM
                  • Ines Aparecida Tozetti
                  • Luana Silva Soares
                  • Marco Antonio Moreira Puga
                  Resumo O Papilomavírus humano (HPV) é um agente infeccioso que tem a capacidade
                  de induzir infecções crônicas sem repercussão sistêmica, e isso ocorre por vários
                  motivos, como: ser exclusivamente intraepitelial, não promover inflamação ou lise
                  celular, causar pouca ou nenhuma viremia, de certa forma, não ativando precocemente
                  os mecanismos de alerta do sistema imune inato. É sabido que devido aos mecanismos
                  pelos quais as células infectadas pelo HPV escapam da vigilância imunológica,
                  incluindo a diminuição e ou alteração do perfil de citocinas, a persistência da infecção
                  viral poderá ocorrer e assim culminar em alterações celulares tais como Lesão
                  intraepitelial escamosa de alto grau (HSIL) e Carcinoma cervical (CC). O estudo sobre
                  perfis de citocinas é de extrema relevância para melhor entendimento sobre a infecção
                  por HPV e a resposta imune do hospedeiro fornecendo assim uma compreensão mais
                  elucidativa sobre citocinas como biomarcadores, possibilitando a busca por novos
                  fármacos, estratégias de diagnósticos e tratamentos. O objetivo deste estudo foi
                  detectar o perfil de citocinas em pacientes com cervicite, lesões cervicais ou
                  carcinoma cervical. Foi realizada para tanto, uma pesquisa descritiva, observacional de
                  corte transversal envolvendo pacientes atendidas no Hospital de Amor, unidade de
                  Campo Grande – MS no durante o ano de 2019 e 2020, onde selecionou-se pacientes
                  submetidas à citologia cervical, biopsia do colo uterino e pesquisa de HPV de alto
                  risco oncogênico (HR-HPV) pelo método Cobas® HPV Test. Foram incluídas no
                  estudo 66 pacientes do com idade entre 25 a 65 anos (média de 42,29 anos). A análise
                  de citocinas em pacientes com cervicite, lesões cervicais ou carcinoma cervical
                  demonstrou que a IL-6 está em maior concentração em pacientes positivas para
                  HPV16 que em relação a pacientes que positivaram para outros tipos de HR-HPV
                  (p<0,05). A IL-17 esteve presente em maior concentração em pacientes com cervicite,
                  HSIL e carcinoma, também em pacientes HPV negativos, embora estes resultados não
                  tenham sido significativos.
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                  Produção, purificação, caracterização e avaliação do potencial biotecnológico da endo-xilanase do fungo termofílo Humicola brevis var. thermoidea
                  Curso Mestrado em Bioquímica e Biologia Molecular
                  Tipo Dissertação
                  Data 10/06/2021
                  Área BIOLOGIA GERAL
                  Orientador(es)
                  • Douglas Chodi Masui
                  Coorientador(es)
                    Orientando(s)
                    • ALINE PEREIRA DE ALMEIDA
                    Banca
                    • Douglas Chodi Masui
                    • Fabiana Fonseca Zanoelo
                    • MARIA DE LOURDES TEIXEIRA DE MORAES POLIZELI
                    • Roberto Ruller
                    Resumo A biodegradação da biomassa lignocelulósica, particularmente da hemicelulose, depende de um grupo de enzimas denominado de complexo hemicelulolítico, produzidas principalmente por fungos e bactérias. Dentre estas hemicelulases, as endo-xilanases têm sido amplamente utilizadas com objetivo de se valorizar a hemicelulose na aplicação em bioprocessos. Neste contexto, o objetivo deste trabalho foi produzir, purificar, caracterizar e avaliar o potencial biotecnológico da endo-xilanase de Humicola brevis var. thermoidea na sacarificação da biomassa lignocelulósica. Com este intuito, a partir do coquetel enzimático obtido através de fermentação em estado sólido, a endo-xilanase nativa (XylHb) foi purificada. A caracterização biofísica das estruturas secundárias por dicroísmo circular indicaram a predominância de folhas β, uma característica típica de endo-xilanases da família GH11 e a análise da fluorescência intrínseca dos Trp indicaram que a proteína tem o seu enovelamento terciário com os resíduos de Trp imersos em um ambiente hidrofóbico. Os resultados das caracterizações bioquímicas e cinéticas da XylHb indicaram que a enzima apresentou uma maior tolerância em uma ampla faixa de pH, temperatura, NaCl e etanol, tendo um melhor desempenho em hidrolisar a xilana birchwood em temperaturas de 50 e 60 ºC quando compara a xilanase comercial (Cellic®HTec2). Os ensaios de hidrólise do bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado hidrotérmicamente demonstraram que a suplementação de Cellic®CTec2 com XylHb apresentaram interações sinérgicas e elevaram significativamente a liberação de glicose e açúcares redutores totais quando comparados ao padrão comercial Cellic®Ctec2 individual. Assim, a XylHb purificada do extrato enzimático de H. brevis var. thermoidea por apresentar propriedades físico-químicas potenciais, performances e sinergismo com celulase comercial, que são características importantes para a aplicação em ambiente industrial, poderá contribuir como uma alternativa biotecnológica promissora para aplicação e valorização da hemicelulose na produção de bioprodutos.
                    Purificação, caracterização bioquímica e imobilização de uma β-glucosidase de Rasamsonia composticola
                    Curso Mestrado em Bioquímica e Biologia Molecular
                    Tipo Dissertação
                    Data 28/05/2021
                    Área BIOLOGIA GERAL
                    Orientador(es)
                    • Fabiana Fonseca Zanoelo
                    Coorientador(es)
                      Orientando(s)
                      • Isabela Pavão Vargas
                      Banca
                      • Douglas Chodi Masui
                      • Fabiana Fonseca Zanoelo
                      • Giovana Cristina Giannesi
                      • Roberto Ruller
                      • Rodrigo Simões Rodrigues
                      Resumo As β-glucosidases são enzimas que fazem parte do complexo celulolítico com a capacidade de atuar sobre materiais lignocelulósicos promovendo sua hidrólise. Essas enzimas são produzidas por microrganismos, principalmente os fungos filamentosos. Possuem variadas aplicações como na indústria de papel e celulose, alimentícia, ração animal e na produção de etanol de segunda geração. O presente trabalho descreve a purificação, características bioquímicas e imobilização de uma β-glucosidase produzida pelo fungo termofílico Rasamsonia composticola. A enzima foi purificada utilizando duas etapas cromatográficas, incluindo a troca iônica DEAE-Fractogel e hidrofóbica Phenyl-Sepharose. Foi purificada 19 vezes com rendimento final de 14%. A β-glucosidase purificada apresentou temperatura ótima de 70°C, permanecendo estável em temperaturas de 65 a 70°C durante até 8 horas, pH 5,0, e uma massa molecular de aproximadamente 45 kDa. A enzima não foi estimulada pela maioria dos compostos químicos testados, entretanto foi levemente estimulada pelos detergentes saponina e triton X-100, além dos quelantes EDTA e EGTA e o agente redutor Temed. A enzima apresentou atividade sobre os substratos sintéticos pNP-Glc e pNP-Xyl, e demonstrou ser tolerante a glicose e estimulada por xilose (1-100 mM). Os parâmetros cinéticos estimados para a β-glucosidase foram de Km e Vmax de 2,3 mM e 0,0221 µmol/min/mg para pNP-Glc. A eficiência catalítica (Kcat/Km) da enzima foi de 7,7x10-11. Para pNP-Glc + glicose e pNP-Glc + xilose a enzima apresentou Km e Vmax de 2,33 mM e 0,0271 µmol/min/mg e 2,02 mM e 0,0255 µmol/min/mg, respectivamente. A enzima foi imobilizada em glioxil agarose cerca de 40% e 56% na presença de glicose durante 60 minutos. Demonstrou atividade ótima em pH 5,0 e 75°C. A enzima imobilizada apresentou estabilidade nas temperaturas de 75 a 80°C durante 60 minutos de reação. Os resultados demonstram que o fungo Rasamsonia composticola pode ser um candidato a contribuir para o conhecimento das propriedades de uma β-glucosidase com grande potencial de aplicação biotecnológica.
                      Efeito de Diaril Dissulfetos sobre Trypanosoma cruzi
                      Curso Mestrado em Bioquímica e Biologia Molecular
                      Tipo Dissertação
                      Data 10/03/2021
                      Área BIOLOGIA GERAL
                      Orientador(es)
                      • Alda Maria Teixeira Ferreira
                      Coorientador(es)
                        Orientando(s)
                        • Bruna Migliorini Melo Silva
                        Banca
                        • Alda Maria Teixeira Ferreira
                        • Alessandra Gutierrez de Oliveira
                        • Edson dos Anjos dos Santos
                        • Fabiana Fonseca Zanoelo
                        • Malson Neilson de Lucena
                        Resumo Trypanosoma cruzi é um protozoário flagelado, considerado o agente etiológico da
                        doença de Chagas. No Brasil, estima-se que mais de três milhões de pessoas sofrem com esta
                        moléstia e que apesar dos investimentos em saneamento básico e ações preventivas para o seu
                        controle, este ainda é um problema sério de saúde, afetando as pessoas mais pobres, que
                        vivem em áreas rurais e com baixas condições de moradia. Os medicamentos atualmente
                        utilizados são pouco eficazes na fase crônica da doença e apresentam uma série de efeitos
                        colaterais. Algumas classes de compostos orgânicos representam alternativas potenciais para
                        o desenvolvimento de novos fármacos. É o caso da classe dos dissulfetos de diarila, cujos
                        compostos apresentam propriedades interessantes que vêm sendo exploradas em diversas
                        áreas da química sintética, farmacêutica e também na produção de polímeros. Sendo assim,
                        este trabalho teve como objetivo a avaliação de cinco compostos sintéticos dessa classe
                        quanto à atividade sobre formas epimastigotas de T. cruzi. A metodologia utilizada envolveu
                        ensaios biológicos para avaliação da viabilidade metabólica e do crescimento dos parasitas,
                        além de ensaio de citotoxicidade em células Vero. Com base nos resultados foi observado que
                        todos os compostos possuem atividade biológica sobre formas epimastigotas de T.cruzi. Os
                        compostos A e D foram os mais ativos no tratamento in vitro durante 72h, apresentando
                        valores de CI50 de 3,5µM e 3,7µM, respectivamente. No entanto, após o tratamento dos
                        parasitos por 24h, os compostos mais ativos foram o D e E, com valores de CL50 de 0,7µM e
                        0,9µM, respectivamente. Quanto à avaliação de citotoxicidade sobre células Vero, os
                        compostos A, C e E apresentaram os maiores valores de CC50 (34,1µM; 32,0µM e 30,5µM,
                        respectivamente), enquanto o composto D mostrou ser o mais citotóxico dentre os cinco
                        testados. Na curva de recuperação, todos os compostos foram capazes de inibir o crescimento
                        dos parasitas em até 96h após a retirada da droga. Observou-se também que o alvo de ação no
                        parasito depende, provavelmente, da posição do ligante em relação à ligação dissulfeto na
                        estrutura dos compostos. Tais resultados indicam a ação dos compostos dissulfetos de diarila
                        sobre mecanismos que influenciam na proliferação celular de T.cruzi, revelando dados
                        promissores para futuras pesquisas.
                        EFEITO DE DISSULFETOS DE DIARILA SOBRE Trypanosoma cruzi
                        Curso Mestrado em Bioquímica e Biologia Molecular
                        Tipo Dissertação
                        Data 10/03/2021
                        Área BIOLOGIA GERAL
                        Orientador(es)
                          Coorientador(es)
                          Orientando(s)
                            Banca
                              Resumo Trypanosoma cruzi é um protozoário flagelado, considerado o agente etiológico da
                              doença de Chagas. No Brasil, estima-se que mais de três milhões de pessoas sofrem com esta
                              moléstia e que apesar dos investimentos em saneamento básico e ações preventivas para o seu
                              controle, este ainda é um problema sério de saúde, afetando as pessoas mais pobres, que
                              vivem em áreas rurais e com baixas condições de moradia. Os medicamentos atualmente
                              utilizados são pouco eficazes na fase crônica da doença e apresentam uma série de efeitos
                              colaterais. Algumas classes de compostos orgânicos representam alternativas potenciais para
                              o desenvolvimento de novos fármacos. É o caso da classe dos dissulfetos de diarila, cujos
                              compostos apresentam propriedades interessantes que vêm sendo exploradas em diversas
                              áreas da química sintética, farmacêutica e também na produção de polímeros. Sendo assim,
                              este trabalho teve como objetivo a avaliação de cinco compostos sintéticos dessa classe
                              quanto à atividade sobre formas epimastigotas de T. cruzi. A metodologia utilizada envolveu
                              ensaios biológicos para avaliação da viabilidade metabólica e do crescimento dos parasitas,
                              além de ensaio de citotoxicidade em células Vero. Com base nos resultados foi observado que
                              todos os compostos possuem atividade biológica sobre formas epimastigotas de T.cruzi. Os
                              compostos A e D foram os mais ativos no tratamento in vitro durante 72h, apresentando
                              valores de CI50 de 3,5µM e 3,7µM, respectivamente. No entanto, após o tratamento dos
                              parasitos por 24h, os compostos mais ativos foram o D e E, com valores de CL50 de 0,7µM e
                              0,9µM, respectivamente. Quanto à avaliação de citotoxicidade sobre células Vero, os
                              compostos A, C e E apresentaram os maiores valores de CC50 (34,1µM; 32,0µM e 30,5µM,
                              respectivamente), enquanto o composto D mostrou ser o mais citotóxico dentre os cinco
                              testados. Na curva de recuperação, todos os compostos foram capazes de inibir o crescimento
                              dos parasitas em até 96h após a retirada da droga. Observou-se também que o alvo de ação no
                              parasito depende, provavelmente, da posição do ligante em relação à ligação dissulfeto na
                              estrutura dos compostos. Tais resultados indicam a ação dos compostos dissulfetos de diarila
                              sobre mecanismos que influenciam na proliferação celular de T.cruzi, revelando dados
                              promissores para futuras pesquisas
                              EXPRESSÃO DE p16 E CITOCINAS IL-6 E TNF-α EM LESÕES CERVICAIS DE PACIENTES POSITIVAS PARA DNA DE PAPILOMAVÍRUS HUMANO DE ALTO RISCO ONCOGÉNICO
                              Curso Mestrado em Bioquímica e Biologia Molecular
                              Tipo Dissertação
                              Data 14/05/2020
                              Área BIOLOGIA GERAL
                              Orientador(es)
                              • Ines Aparecida Tozetti
                              Coorientador(es)
                                Orientando(s)
                                • Andrielli Rodrigues dos Santos
                                Banca
                                • Alda Maria Teixeira Ferreira
                                • Cacilda Tezelli Junqueira Padovani
                                • Camila Mareti Bonin Jacob
                                • Ines Aparecida Tozetti
                                Resumo A infecção pelo Papilomavírus humano (HPV) representa o principal fator de risco para o
                                desenvolvimento do câncer cervical e da p16 no ciclo celular, pode ser utilizada como indicador
                                da participação do HPV na carcinogênese de células epiteliais. Sabe-se que tanto a imunidade
                                natural, quanto a adaptativa exercem papel importante na eliminação de tumores, sendo que
                                alguns componentes da resposta imune, tais como: a interleucina-6 (IL-6), o TNF-α (fator de
                                necrose tumoral) capazes de modular o processo inflamatório crônico induzindo a proliferação,
                                invasão e metástase de células tumorais. A partir disso, este estudo tem como objetivo detectar
                                a expressão de p16 e das citocinas IL-6 e TNF-α em lesões cervicais de pacientes positivas para
                                DNA de HPV de alto risco oncogênico. Foram analisados cortes histológicos de cérvice uterina
                                provenientes de 12 pacientes submetidas previamente à detecção de DNA de HPV, pelo método
                                cobas® HPV Test, com resultados histopatológicos de Lesão intraepitelial escamosa de alto
                                grau (HSIL). A imunohistoquímica de marcação simples foi realizada utilizando recuperação
                                antigênica por calor úmido, sistema HiDef Detection HRP Polymer System (Cell Marque,
                                California, USA) e os anticorpos primários anti-IL-6 (Abcam©, ab9324), anti-TNF-α
                                (Abcam©, ab8348) e anti-P16 (Abcam©, ab51243). As células imunomarcadas presentes no
                                estroma da cérvice uterina e no epitélio foram detectadas e quantificadas através dos softwares
                                Motic Images Plus 2.0 e Image J. 1.47 (National Institutes of Health, EUA), acoplados ao
                                microscópio Nikon Eclipse E200 (Nikon, NY, USA) e câmera digital Moticam 2300 3.0
                                Megapixels. Observou-se maior número de células imunomarcadas para IL-6 (16790
                                células/mm2) quando a expressão de p16 foi difusa fraco, talvez representando um possível
                                papel na regressão das lesões, enquanto a imunomarcação de TNF-α foi presente em maior
                                número de células (9270 células/mm2) quando a expressão de p16 apresentou-se com o padrão
                                difuso/forte nas amostras positivas para DNA de HPV de alto risco oncogênico. A expressão
                                da p16, quando observada no epitélio, apresentou padrão difuso/forte.
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                                  Produção e Caracterização Bioquímica de Xilanase Produzida pelo Fungo Termofílico Rasamsonia composticola utilizando resíduos agroindustriais
                                  Curso Mestrado em Bioquímica e Biologia Molecular
                                  Tipo Dissertação
                                  Data 13/03/2020
                                  Área BIOLOGIA GERAL
                                  Orientador(es)
                                  • Fabiana Fonseca Zanoelo
                                  Coorientador(es)
                                    Orientando(s)
                                    • Daniel Guerra Franco
                                    Banca
                                    • Douglas Chodi Masui
                                    • Fabiana Fonseca Zanoelo
                                    • Malson Neilson de Lucena
                                    • Newton Valério Verbisck
                                    Resumo Os fungos filamentosos são micro-organismos capazes de produzir inúmeras enzimas de
                                    interesse biotecnológico. Dentre essas enzimas, as xilanases, merecem destaque uma vez
                                    que são responsáveis pela degradação da xilana, o segundo polissacarídeo mais abundante
                                    na natureza. Essas enzimas apresentam potencial de aplicação nas indústrias têxtil, de
                                    alimentos, de detergentes e na produção de bioetanol de segunda geração. Nesse estudo
                                    foi realizado a otimização da produção de xilanase utilizando resíduos agroindustriais em
                                    fermentação em estado sólido para um fungo mesofílico, o Aspergillus flavus e outro
                                    termofílico, o Rasamsonia composticola e posteriormente a enzima foi purificada e
                                    caracterizada Após determinar R. composticola como o melhor produtor de xilanase, a
                                    enzima foi purificada utilizando-se dois métodos cromatográficos: resina hidrofóbica
                                    (Phenyl-Sepharose), seguida de exclusão por peso molecular (Sephacryl-S200). Foram
                                    obtidos um fator de purificação de 30,6 vezes e rendimento de 22%. A análise em gel de
                                    poliacrilamida em condições desnaturantes (SDS-PAGE 12%), não-desnaturantes
                                    (PAGE) e zimograma demonstraram uma única banda e um peso molecular estimado de
                                    53 kDa. A enzima apresentou um pH e temperatura ótimos de 5.5 e 80°C,
                                    respectivamente, e quando incubada a 70°C por 30 minutos a enzima mantém 100% de
                                    atividade. A enzima foi estimulada em 20% utilizando 1mM MgSO4, inibida por 5 mM
                                    de CuSO4, e estável na presença dos detergentes saponina e Triton X-100. Os solventes
                                    orgânicos acetona e etanol ativaram a atividade enzimática em 85 e 75%,
                                    respectivamente. A xilanase hidrolisou os substratos: xilana oat spelt, xilana birchwood,
                                    CMC e Avicel, tendo apresentado um Km de 2,3±0,59 e 6,7±0,7 mg/mL, e Vmax de 173,7
                                    ±6,5 e 446,7±12,7 μmol/min/mg para Xilana birchwood e Xilana oat spelt,
                                    respectivamente. Não houve inibição por compostos fenólicos mesmo após 8 horas de
                                    incubação. No teste de armazenamento, a enzima foi estável após 7 dias em temperatura
                                    ambiente (22°). Os resultados demonstraram que a xilanase de R. composticola possui
                                    características bioquímicas com grande potencial para aplicações biotecnológicas.
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                                      Purificação e caracterização de uma poligalacturonase produzida por Aspergillus japonicus e sua aplicação na clarificação de sucos de frutas
                                      Curso Mestrado em Bioquímica e Biologia Molecular
                                      Tipo Dissertação
                                      Data 13/03/2020
                                      Área BIOLOGIA GERAL
                                      Orientador(es)
                                      • Giovana Cristina Giannesi
                                      Coorientador(es)
                                        Orientando(s)
                                        • Larissa Costa Olarte
                                        Banca
                                        • Douglas Chodi Masui
                                        • Giovana Cristina Giannesi
                                        • Jeandre Augusto Otsubo Jaques
                                        • Malson Neilson de Lucena
                                        Resumo Pectinases (EC 3.2.1.15) são enzimas que catalisam a hidrólise da pectina, um dos
                                        principais polissacarídeos da parede primária de plantas superiores. Fungos
                                        filamentosos, principalmente do gênero Aspergillus, são eficientes produtores de
                                        enzimas pectinolíticas. Dentre as pectinases, poligalacturonases têm sido
                                        extensivamente estudadas devido às suas potenciais aplicações, como por exemplo o,
                                        nas industrias de alimentos, promovendo a clarificação de suco de frutas. Apesar das
                                        diversas aplicações industriais, o alto custo e a instabilidade, faz com que o uso
                                        comercial das enzimas permaneça limitado. A produção rápida e purificação de enzimas
                                        em poucas etapas é uma opção na superação desses obstáculos. O objetivo desse
                                        trabalho foi purificar e caracterizar uma exo-PGase produzida por Aspergillus japonicus
                                        e a clarificação de suco de frutas. Entre os 7 fungos testados, A. japonicus mostrou a
                                        melhor produção de PGase (0,389 U/mL) em meio líquido e purificação de 9,5 vezes
                                        com 103% de rendimento. A enzima apresentou um peso molecular de
                                        aproximadamente de 34 kDa (SDS-PAGE). O pH e a temperatura ótima para atividade
                                        da enzima foi 5,0 e 55 °C, respectivamente. A 50°C a enzima apresentou meia vida após
                                        10 min. Em pH 6,0 manteve-se estável durante 2h. Os íons CuSO4, FeCl3 e HgCl3
                                        inibiram totalmente a atividade na concentração de 5mM. Em relação ao substrato, a
                                        PGase mostrou maior especificidade (8,81 U/mL) para pectina de maçã. A enzima foi
                                        classificada como exo-poligalacturonase por cromatografia em camada delgada de
                                        sílica. O suco tratado com a enzima purificada (2 U/mL) proporcionou um aumento de
                                        95,7%, 85,7% e 35,5% na clarificação da manga tommy, manga keitt e laranja,
                                        respectivamente. A PGase de A. japonicus mostra potencial para ser aplicada na
                                        clarificação de suco de frutas.
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                                          Purificação e caracterização bioquímica de uma beta-glucosidase do fungo termófilo Humicola brevis var. thermoidea.
                                          Curso Mestrado em Bioquímica e Biologia Molecular
                                          Tipo Dissertação
                                          Data 12/03/2020
                                          Área BIOLOGIA GERAL
                                          Orientador(es)
                                          • Douglas Chodi Masui
                                          Coorientador(es)
                                            Orientando(s)
                                            • Luciane Gomes Freire
                                            Banca
                                            • Douglas Chodi Masui
                                            • Fabiana Fonseca Zanoelo
                                            • Giovana Cristina Giannesi
                                            • Roberto Ruller
                                            Resumo A biodegradação da biomassa lignocelulósica, particularmente da celulose, depende de
                                            enzimas produzidas principalmente por microorganismos. Entre outras enzimas, as celulases e
                                            -glucosidases atuam de forma a liberar unidades de celo-oligossacarídeos e glicose. Porém, a
                                            maioria dessas celulases sofre uma inibição pela ação do seu próprio produto, além de serem
                                            fortemente inibidas por glicose. O fungo termófilo Humicola brevis var. thermoidea mostrou
                                            ser um bom produtor de uma β-glucosidase tolerante à glicose e estimulada por xilose, em
                                            meio de cultivo sólido, simples e barato, constituído por somente farelo de trigo e água. A
                                            clivagem da ligação glicosídica dos celo-oligossacarídeos e celobiose por β-glucosidase
                                            estimuladas ou tolerantes à presença de glicose é de grande interesse industrial, pois é uma
                                            enzima chave no processo de sacarificação de resíduos lignocelulósicos. Avanços em
                                            processos biotecnológicos estão sendo desenvolvidos com objetivo de produzir diferentes
                                            produtos químicos e/ou melhorar outros produtos como bioetanol de 2a geração, nas indústrias
                                            de alimentos, panificação, bebidas, têxtil e de papel e celulose. Nesse contexto, o objetivo
                                            deste trabalho foi a purificação e caracterização bioquímica de uma β-glucosidase de H. brevis
                                            var. thermoidea. A enzima β-glucosidase foi purificada até a sua homogeneidade após 4
                                            passos cromatográficos, onde apresentou um rendimento final de 17% e um fator de
                                            purificação de 362,7 vezes. A massa molecular estimada por SDS-PAGE foi de 125kDa. A
                                            enzima demonstrou-se resistente a temperaturas mais altas, apresentando a atividade máxima
                                            entre 60 e 65oC e declínio após este ponto, apresentou meia-vida após 3 horas a 60oC e
                                            manteve-se praticamente estável a partir deste ponto até 8 h. Além disso, os parâmetros
                                            avaliados indicam que esta enzima tem sua atividade ótima em pH 5,0 sendo praticamente
                                            estável a um pH de 2,5 a 8,0. A maioria dos íons, agentes redutores e quelantes, estimularam a
                                            atividade da enzima. Os resultados demonstram que H. brevis pode ser um candidato a
                                            contribuir para o conhecimento das propriedades de uma enzima com grande potencial de
                                            aplicação biotecnológica.
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                                              Bioprospecção de Fungos Filamentosos do Pantanal Sul Mato-Grossense Produtores de Moléculas Indutoras de Crescimento em Plantas
                                              Curso Mestrado em Bioquímica e Biologia Molecular
                                              Tipo Dissertação
                                              Data 06/03/2020
                                              Área BIOLOGIA GERAL
                                              Orientador(es)
                                              • Fabiana Fonseca Zanoelo
                                              Coorientador(es)
                                                Orientando(s)
                                                • Rodrigo Mattos Silva Galeano
                                                Banca
                                                • Bianca Obes Correa
                                                • Fabiana Fonseca Zanoelo
                                                • Maria Rita Marques
                                                • Marivaine da Silva Brasil Mansur Cardoso
                                                Resumo Os fertilizantes e agrotóxicos são utilizados há muito tempo como estratégias para o
                                                aumento de produtividade agrícola. Entranto, o uso excessivo desses insumos
                                                causam impactos negativos ao meio ambiente. Uma alternativa sustentável para
                                                minimizar esse prejuízo é o uso de fungos filamentosos com mecanismos para
                                                promoção de crescimento vegetal como biofertilizantes, minimizando os impactos
                                                causados por estes agroquímicos. Portanto, o objetivo deste trabalho foi prospectar
                                                fungos filamentosos do Pantanal Sul Mato-Grossense produtores de moléculas
                                                indutoras de crescimento de plantas. Neste estudo, a capacidade de 60 isolados de
                                                produzir o AIA foi o primeiro critério de seleção para os estudos posteriores deste
                                                trabalho. Em seguida, sete isolados foram escolhidos para analisar a produção do
                                                molécula em diferentes parâmetros físico-químicos, produção de sideróforos e
                                                atividade solubilizadora de fosfato. Os cinco isolados com maior potencial
                                                solubilizador de fósforo, foram analisados em relação a produção de amônia, ACC
                                                deaminase, HCN, hidrolases e proteases. O isolado mais promissor foi escolhido para
                                                testes de antibiose, identificação molecular e avalição do efeito da inoculação em
                                                feijão. A partir dos resultados obtidos, o isolado Aspergillus sp. 9-P foi escolhido pois
                                                apresentou os mecanismos diretos (AIA, sideróforos, solubilização de fosfato, ACC
                                                deaminase) e indiretos (amônia, hidrolases e proteases, exceto HCN) para promoção
                                                de crescimento vegetal. Na antibiose, o isolado apresentou bom antagonismo contra
                                                Fusarium solani e Rhizoctonia sp. A identificação molecular mostrou alta similaridade
                                                do isolado com Aspergillus niger. Finalmente, a inoculação em feijão proporcionou
                                                efeitos benéficos na altura, massa fresca e seca da parte aérea e raiz das plantas de
                                                feijão em relação ao tratamento sem inoculação. Portanto, o isolado Aspergillus niger
                                                9-P parece ser um ótimo candidato para a formulação de biofertilizantes visando a
                                                promoção de crescimento vegetal na agricultura.
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                                                  Avaliação do potencial anti-Trypanosoma cruzi de protolimonoides isolados de Guarea kunthiana A. Juss. (Meliaceae)
                                                  Curso Mestrado em Bioquímica e Biologia Molecular
                                                  Tipo Dissertação
                                                  Data 28/02/2020
                                                  Área BIOLOGIA GERAL
                                                  Orientador(es)
                                                  • Alda Maria Teixeira Ferreira
                                                  Coorientador(es)
                                                    Orientando(s)
                                                    • Letícia Alves da Cruz
                                                    Banca
                                                    • Alda Maria Teixeira Ferreira
                                                    • Carlos Eurico dos Santos Fernandes
                                                    • Fernanda Rodrigues Garcez
                                                    • Maria Carolina Silva Marques
                                                    Resumo A doença de Chagas é uma doença infecciosa causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi.
                                                    Anualmente, são registrados cerca de oito milhões de casos de infecção por T. cruzi e dez mil
                                                    mortes, em decorrência das complicações da doença. O único tratamento disponível, que
                                                    consiste na administração do benzonidazol, provoca inúmeras reações adversas aos pacientes,
                                                    além de ser frequentemente pouco eficaz na fase crônica da doença. Nessa perspectiva, destaca-
                                                    se a importância de mais estudos a fim de evidenciar novos compostos com atividade anti-T.
                                                    cruzi, gerando novas possibilidades para o tratamento da doença. Diante disso, realizamos uma
                                                    investigação química dos frutos de Guarea kunthiana, guiado pelo efeito contra as formas
                                                    epimastigotas de T. cruzi (Dm28c). O estudo químico das fases ativas resultou no isolamento
                                                    dos protolimonoides melianona e 3β-O-tigloilmelianol da fase hexânica, e melianodiol,
                                                    melianotriol, melianol e 3β-O-tigloilmelianotriol da fase diclorometânica. Aqui, mostramos
                                                    pela primeira vez o efeito promissor dos seis protolimonoides isolados de G. kunthiana contra
                                                    as três principais formas celulares do parasita e descrevemos um possível mecanismo de ação
                                                    dos compostos sobre as formas replicativas de T. cruzi. Com relação ao efeito sobre as formas
                                                    epimastigotas e tripomastigotas destacaram-se os protolimonoides que possuem grupo hidroxila

                                                    em C-3, enquanto que, em relação às formas amastigotas, o composto com grupo tigloil em C-
                                                    3 e ligação epóxido em C-24/25 provocou maiores danos sobre o crescimento intracelular. A

                                                    incubação das formas replicativas de T. cruzi com os protolimonoides resultou, principalmente,
                                                    na desintegração do kDNA, inchaço e circularização da membrana mitocondrial. Os danos
                                                    funcionais na mitocôndria foram confirmados por citometria de fluxo com Rodamina 123.
                                                    Portanto, sugerimos que os danos estruturais e funcionais na mitocôndria dos parasitas podem
                                                    explicar o notável efeito antiproliferativo dos protolimonoides sobre T. cruzi. Em adição,
                                                    mostramos alterações ultraestruturais associadas ao grupo em C-3 dos compostos, por exemplo,
                                                    a desestruturação do aparelho de Golgi nas formas epimastigotas, observadas apenas na
                                                    presença dos protolimonoides com grupo tigloil em C-3, sugerindo mecanismos de ação
                                                    possivelmente distintos entre os compostos. Nossos resultados mostram a potencialidade dos
                                                    protolimonoides como agente antiparasitário, representando uma alternativa promissora no
                                                    desenvolvimento de novas drogas contra infecção por T. cruzi.
                                                    Atividade antimicrobiana e o mecanismo de ação de um peptídeo sintético contra bactérias patogênicas
                                                    Curso Mestrado em Bioquímica e Biologia Molecular
                                                    Tipo Dissertação
                                                    Data 20/02/2020
                                                    Área BIOLOGIA GERAL
                                                    Orientador(es)
                                                    • Maria Ligia Rodrigues Macedo
                                                    Coorientador(es)
                                                      Orientando(s)
                                                      • Claudiane Vilharroel Almeida
                                                      Banca
                                                      • Douglas Chodi Masui
                                                      • Janaina de Cassia Orlandi Sardi
                                                      • Maria Ligia Rodrigues Macedo
                                                      • Simone Maria Neto
                                                      Resumo A disseminação de cepas bacterianas resistentes aos antibióticos de uso
                                                      convencional é um dos principais problemas de saúde mundial. Os peptídeos
                                                      antimicrobianos (PAMs) têm sido considerados uma das alternativas para o controle
                                                      de infecções bacterianas. Apresentam atividade em amplo espectro e a capacidade
                                                      de eliminar células-alvo rapidamente. Este trabalho teve por objetivo caracterizar a
                                                      estrutura de um PAM obtido através do desenho com auxílio computacional,

                                                      determinar seu mecanismo de ação contra bactérias patogênicas. Parâmetros físico-
                                                      químicos e estruturais foram previamente projetados através de ferramentas

                                                      computacionais. Após síntese química, a concentração inibitória mínima (CIM),
                                                      concentração bactericida mínima (CBM) e a atividade antibiofilme foram avaliadas. A
                                                      estrutura secundária na presença de água e condições que mimetizam as membranas
                                                      biológicas foi obtida por dicroísmo circular (CD) e o teste de atividade citotóxica in vitro

                                                      e in vivo foi realizado. O peptídeo catiônico e anfipático desenhado, denominado RQ-
                                                      18, contém 18 resíduos de aminoácidos de comprimento e mostrou atividade

                                                      antimicrobiana contra bactérias Gram-negativas e Gram-positivas. A CIM para
                                                      Escherichia coli foi de 2 μM e CBM de 5 μM. Em contraste, Staphylococcus
                                                      saprophyticus sofreu efeito bactericida no mesmo CIM (2 μM). A atividade peptídica
                                                      contra isolados de E. coli causadores de infecções bovinas também foi analisada,
                                                      mostrando ação bactericida na concentração de 6 μM. O peptídeo também foi capaz
                                                      de inibir o crescimento de biofilme da cepa resistente a carbapenemase E.coli em
                                                      concentração a 3,7 μM. Ensaios de extravasamento celular e de captação de cristal
                                                      violeta indicam que a atividade antimicrobiana pode ser mediada por danos na
                                                      membrana bacteriana. O RQ-18 apresentou ausência completa de citotoxicidade dos
                                                      fibroblastos pulmonares humanos (MRC-5), em células vero (CCL-81), em eritrócitos
                                                      e no ensaio in vivo com Corcyra cephalonica, demonstrando ser seguro. Finalmente,
                                                      análises de CD mostraram que o RQ-18 assumiu uma estrutura aleatória na água.
                                                      Caso contrário, TFE (50%) e SDS (30 mM) induzem uma conformação helicoidal. Em
                                                      resumo, RQ-18 representa uma estratégia promissora para o desenvolvimento de um
                                                      novo agente antimicrobiano para ajudar na diminuição da infecção por resistência aos
                                                      antibióticos.
                                                      Caracterização da atividade da adenosina desaminase em linfócitos e plaquetas humanos
                                                      Curso Mestrado em Bioquímica e Biologia Molecular
                                                      Tipo Dissertação
                                                      Data 01/03/2019
                                                      Área BIOLOGIA GERAL
                                                      Orientador(es)
                                                      • Fabiana Fonseca Zanoelo
                                                      Coorientador(es)
                                                        Orientando(s)
                                                        • Luciana Rocha Costa
                                                        Banca
                                                        • Fabiana Fonseca Zanoelo
                                                        • Giovana Cristina Giannesi
                                                        • Jeandre Augusto Otsubo Jaques
                                                        • Luciane Candeloro
                                                        Resumo A conversão da adenosina em inosina é catalisada pela enzima adenosina
                                                        desaminase (E-ADA; EC 3.5.4.4), que possui duas isoformas em humanos e pertence
                                                        à família das hidrolases dependentes de zinco. A E-ADA pode modular a função dos
                                                        linfócitos, desempenhando também importante papel no desenvolvimento de tecidos,
                                                        e na função das plaquetas, devido a sua interferência no processo de angiogênese e
                                                        agregação plaquetária. A quantificação da atividade da E-ADA em linfócitos e
                                                        plaquetas humanos já foi previamente realizada, porém não há na literatura estudos
                                                        apresentando a sua caracterização bioquímica e cinética detalhada. Assim,
                                                        evidenciou-se a necessidade de caracterização da atividade da E-ADA em linfócitos
                                                        e plaquetas isolados de sangue periférico de humanos, na ausência de processos
                                                        patológicos envolvidos. Antes do início da caracterização enzimática foi realizado
                                                        ensaio de viabilidade das células mononucleadas (PBMC) ricas em linfócitos, que
                                                        apresentou 88,4% de células com membrana íntegra após 20 horas. Na citometria de
                                                        fluxo, observou-se que 53,8 ± 6,8% de células do PBMC no gate dos linfócitos foram
                                                        marcadas com o anticorpo anti-CD26. Nos linfócitos, a atividade enzimática foi linear
                                                        de 15 a 120 minutos de incubação, com 2,5 a 12,5 µg de conteúdo de proteína e entre
                                                        a faixa de pH 6.0 a 7.4. Já nas plaquetas, a atividade foi linear de 15 a 105 minutos
                                                        de incubação, com 7,5 a 20 µg de conteúdo de proteína e entre a faixa de pH 6.0 a
                                                        7.4. Para linfócitos, o Km aparente e Vmax foram 0,103 ± 0,051 mM e 0,025 ± 0,001
                                                        nmol de NH3/min/mg de proteína, respectivamente. Para plaquetas, o Km aparente foi
                                                        0,0017 ± 0,00045 mM e a Vmax foi 0,004 ± 0,0001 nmol de NH3/min/mg de proteína. O
                                                        zinco (5 mM) exerceu inibição na atividade enzimática em ambas as células, porém o
                                                        efeito preventivo do EDTA foi observado apenas nos linfócitos. A E-ADA nos linfócitos
                                                        apresentou preferência pela adenosina como substrato em relação à 2’-
                                                        desoxiadenosina e guanosina, enquanto que nas plaquetas observou-se preferência
                                                        pela adenosina apenas quando comparada à guanosina. O EHNA apresentou inibição
                                                        significativa da atividade da E-ADA nos linfócitos e nas plaquetas (>90%),
                                                        demonstrando a predominância da isoforma ADA1 nestas células.
                                                        O uso de ferramentas computacionais na busca de novos peptídeos com atividade antimicrobiana
                                                        Curso Mestrado em Bioquímica e Biologia Molecular
                                                        Tipo Dissertação
                                                        Data 06/02/2019
                                                        Área BIOLOGIA GERAL
                                                        Orientador(es)
                                                        • Maria Ligia Rodrigues Macedo
                                                        Coorientador(es)
                                                          Orientando(s)
                                                          • Luís Henrique de Oliveira Almeida
                                                          Banca
                                                          • Fabiana Fonseca Zanoelo
                                                          • Maria Ligia Rodrigues Macedo
                                                          • Simone Maria Neto
                                                          • Suzy Wider Machado
                                                          Resumo Os peptídeos antimicrobianos (PAMs) são uma nova classe de substâncias com capacidade de eliminar microrganismos patológicos e possuem um amplo espectro de atividade. Essas moléculas são obtidas de fontes naturais, mas também podem ser sintetizadas em laboratórios com o auxílio da tecnologia, economizando tempo e recursos financeiros ou humanos. Esse trabalho teve por objetivo o desenvolvimento de um PAM de cadeia curta com atividade antimicrobiana comprovado em experimentos in vitro. A partir de uma proteína denominada ApTI, um inibidor de tripsinas de Adenanthera pavonina, foram obtidos peptídeos com dezoito resíduos de aminoácidos através da clivagem in silico da cadeia de aminoácidos pelo software CAMPR3. Posteriormente, a sequência com as melhores predições para peptídeo antimicrobiano foi analisada no APD3 Databse. A roda helicoidal, gerada pelo software Helical foi utilizada para verificar o caráter anfipático das moléculas e, assim, fazer as devidas modificações estruturais com intuito de obter uma molécula com potencial atividade antimicrobiana. A modelagem Ab initio foi feita utilizando o software I-TASSER e validada pelo software PROCHECK. Dentre os peptídeos obtidos foi escolhido o que apresentou maior probabilidade de ser antimicrobiano, onde as modificações na sequência original resultaram no peptídeo denominado Adepamicina, com tendência a formar α-hélice de caráter anfipático apresentando características com melhor potencial de um PAM, quando comparado a estrutura de origem, e homologia com outros PAMs. Para comprovação da ação antimicrobiana foram feitos ensaios de atividade antimicrobiana in vitro, obtendo a concentração inibitória mínima (CIM) para as bactérias Escherichia coli, Klebsiella oxytoca, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa e Staphylococcus aureus, seguindo o protocolo M2-A8 disponível pela Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), assim como outros ensaios biológicos que comprovassem a eficácia do peptídeo, como o ensaio hemolítico, onde foi comprovado que em baixíssimas concentrações o peptídeo não compromete células eucarióticas. Uma breve investigação do mecanismo de ação de Adepamicina frente Escherichia coli foi determinado, sendo este o modelo bacteriano escolhido pois apresentou a menor CIM, 0,9 μM.
                                                          AVALIAÇÃO DA PRODUÇÃO DE LIPASE A PARTIR DO CONSUMO DE GLICEROL INDUSTRIAL POR FUNGOS FILAMENTOSOS: PURIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DO MELHOR PRODUTOR
                                                          Curso Mestrado em Bioquímica e Biologia Molecular
                                                          Tipo Dissertação
                                                          Data 03/08/2018
                                                          Área BIOLOGIA GERAL
                                                          Orientador(es)
                                                          • Giovana Cristina Giannesi
                                                          Coorientador(es)
                                                            Orientando(s)
                                                            • John Dayvan Maidana Serpa
                                                            Banca
                                                            • Douglas Chodi Masui
                                                            • Edson dos Anjos dos Santos
                                                            • Fabiana Fonseca Zanoelo
                                                            • Giovana Cristina Giannesi
                                                            Resumo Lipases (EC 3.1.1.3) são acilhidrolases que catalisam a hidrólise e síntese de ésteres formados de glicerol e ácidos graxos e apresentam a capacidade de hidrolisar substratos hidrofóbicos em meio hidrofílico na interface lipídio-água. As lipases de aplicação industrial são preferencialmente obtidas de microrganismos como, Penicillium, Acremonium e Aspergillus, podendo ser empregadas em: processamento de óleos e gorduras, formulação de detergentes, síntese de fármacos e produção de biodiesel. Com relação à produção de biocombustíveis, o emprego de lipases de microrganismos substitui a hidrólise alcalina e facilita a recuperação do glicerol formado como subproduto. O glicerol pode ser usado nos setores alimentícios, cosmético, produção de papel, tecidos e tintas e, mais recentemente, vem sendo empregado no crescimento microbiano. O objetivo desse trabalho é avaliar a produção de lipase a partir do consumo de glicerol industrial por fungos filamentosos, purificar e caracterizar a enzima do melhor produtor. Na produção de lipase, S. strictum apresentou maior produção enzimática (3,13 U/mg) em glicerol industrial seguido de óleo de girassol (2,63 U/mg), enquanto Penicillium solitum teve a maior produção enzimática em azeite de oliva (0,48 U/mg), ambos em 168 h de crescimento em agitação constante (110 rpm). O pH ótimo das lipases de S. strictum e P. solitum foi 5,0, enquanto a lipase de S. strictum manteve-se estável por 120 min com 100 % de atividade, a de P. solitum foi estável pelo mesmo período em pH 7,0 e 8,0. A lipase de S. strictum foi purificada usando três colunas cromatográficas (DEAE-celulose, Sephacryl S-200 e Octyl-sepharose) com fator final de purificação de 24,4 vezes e rendimento de 16,1 %. A lipase purificada de S. strictum foi estável na presença de surfactante e detergentes (goma arábica, Triton™ X-100, TWEEN® 20 e TWEEN® 80); porém, mantendo entre zero e 4,72 % de atividade na presença de SDS. A lipase também foi estável na presença de metanol (80 %), DMSO e acetona (60 %); entretanto, apresentou atividade abaixo de 50 % nos demais solventes orgânicos (etanol, isopropanol, n-butanol e acetonitrila). A enzima exibiu atividade sobre p-NPP, p-NPM e p-NPO com atividade específica de 2,82, 4,09 e 8,71 U/mg, respectivamente. O teste de reuso da lipase imobilizada em alginato de sódio mostrou retenção de 70 % de atividade no segundo ciclo e 30 % no terceiro. As melhores concentrações de glicerol industrial usado como fonte de carbono foram: 0,5; 1; 2; 4 e 6 % para P. solitum e S. strictum. O uso do glicerol industrial como fonte de carbono para a produção de lipase pelo S. strictum mostrou-se uma alternativa viável, econômica e eco-amigável. Além disso, revelou a possibilidade para novas investigações em aplicações industriais, principalmente no setor de conversão do glicerol em produtos de valor econômico agregado.
                                                            Síntese de ácidos graxos poli-insaturados (PUFAs) a partir de glicerol por fungos filamentosos
                                                            Curso Mestrado em Bioquímica e Biologia Molecular
                                                            Tipo Dissertação
                                                            Data 08/06/2018
                                                            Área BIOLOGIA GERAL
                                                            Orientador(es)
                                                            • Maria Rita Marques
                                                            Coorientador(es)
                                                            • Sayuri Myamoto
                                                            Orientando(s)
                                                            • Luís Henrique Camargo Costa
                                                            Banca
                                                            • Denis Pires de Lima
                                                            • Edson dos Anjos dos Santos
                                                            • Fabiana Fonseca Zanoelo
                                                            • Maria Rita Marques
                                                            Resumo Em função da crescente busca por biocombustíveis, a produção de biodiesel tende a aumentar gerando uma preocupação com o seu principal subproduto: o glicerol. Devido ao baixo valor comercial e o potencial impacto ambiental negativo, atribuído à superprodução do glicerol, torna-se fundamental encontrar formas alternativas de conversão deste subproduto em produtos com maior valor agregado. Neste contexto, este trabalho teve como objetivo selecionar fungos endofíticos isolados de Aspilia grazielae (Santos) com potencial para produção de ácidos graxos poli-insaturados (PUFAs) utilizando o glicerol como substrato. Cinquenta e uma cepas isoladas da planta, sendo 18 do gênero Aspergillus spp.; 13 do gênero Colletotrichum spp.; 10 do gênero Penicillium spp. e 10 do gênero Fusarium spp. foram submetidas a testes de pré-seleção. Destas cepas, Aspergillus sp. (FF5), Aspergillus sp. (FF3) e Penicillium sp. (BR10) foram capazes de produzir lipídios utilizando glicerol como fonte de carbono. O perfil dos ácidos graxos foi determinado pela análise de CG/MS, onde foi possível detectar os ácidos graxos majoritários: linolênico (C18:3) e linoleico (C18:2), correspondendo a 90,04 % produzidos pela cepa Aspergillus spp.(FF5), 89,61 % produzidos por Aspergillus spp.(FF3) e 75,69 % produzidos por Penicillium spp. (BR10). A utilização do glicerol como fonte de carbono para produção de ácidos graxos poli–insaturados (PUFAs) através de ensaios de biotransformação deve ser considerada uma alternativa plausível para absorver e agregar valor ao excedente deste composto proveniente da indústria de biocombustíveis.
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