Mestrado em Bioquímica e Biologia Molecular

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Efeito de dissulfetos de diarila sobre formas epimastigotas e tripomastigotas de Trypanosoma cruzi
Curso Mestrado em Bioquímica e Biologia Molecular
Tipo Dissertação
Data 24/03/2023
Área BIOLOGIA GERAL
Orientador(es)
  • Alda Maria Teixeira Ferreira
Orientando(s)
  • Anny Beatriz da Silva
Banca
  • Alda Maria Teixeira Ferreira
  • Carla Leticia Gediel Rivero Wendt
  • Edson dos Anjos dos Santos
  • Malson Neilson de Lucena
  • Maria Carolina Silva Marques
Resumo O presente trabalho tem como objetivo a avaliação do efeito dos compostos sintéticos dissulfetos de diarila em formas replicativas e infectiva do agente etiológico da Doença de Chagas (DC), o protozoário Trypanosoma cruzi. A DC é uma enfermidade endêmica da América Latina, representando um problema grave de saúde pública, pois acomete cerca de 6 milhões de pessoas no mundo. Nessa perspectiva, destaca-se a importância de mais pesquisas a serem desenvolvidas a fim de evidenciar novos compostos com atividades anti- Trypanosoma que apresentem baixa citotoxicidade e possam representar uma nova alternativa interessante para o tratamento dessa doença. Há relatos na literatura de compostos de dissulfetos de diarila com atividade antiproliferativa contra células tumorais, assim como ação sobre protozoários. Sendo assim, este estudo propõe avaliar o efeito in vitro de compostos dissulfetos de diarila, sobre as formas replicativa e infectiva de T. cruzi. Foram realizados ensaios biológicos de viabilidade, crescimento, análise morfológica para formas epimastigotas e viabilidade de formas tripomastigotas. Foi realizado também o ensaio in silico para análise das propriedades ADMET dos compostos. Durante a análise das propriedades ADMET foi observado que os compostos apresentam boa absorção e não apresentam hepatotoxicidade ou mutagenicidade. No ensaio de viabilidade foi observado que os compostos possuem atividade biológica sobre as formas epimastigotas de T. cruzi, sendo os compostos D e E os mais ativos (3,124 e 5,091µM, respectivamente). A curva de crescimento demonstrou que a partir de 24h de exposição o composto D causou uma inibição de 50% e em 96h de exposição, essa inibição foi de 19,64%, demonstrando uma redução de atividade conforme o tempo de exposição. O ensaio de recuperação realizado com os compostos B, C e D mostrou que após 96h os valores de inibição estavam entre 26% e 40%, indicando uma ação tripanostática. A análise morfológica realizada com os compostos B e D, indicou que esses compostos causam alterações morfológicas que afetam a viabilidade do parasito. O ensaio de viabilidade com formas tripomastigotas tratadas com o composto D, indicou que o composto possui ação sobre a forma infectante do parasito, com uma CI50 de 10,90 µM.

Palavras-chave: Disulfetos de Diarila, Trypanosoma cruzi, doença de Chagas.
Efeito da combinação de isoobtusilactona A e protolimonóides biologicamente ativos sobre epimastigotas de Trypanosoma cruzi
Curso Mestrado em Bioquímica e Biologia Molecular
Tipo Dissertação
Data 21/03/2023
Área BIOLOGIA GERAL
Orientador(es)
  • Alda Maria Teixeira Ferreira
Orientando(s)
  • Bruna Castro de Barros
Banca
  • Alda Maria Teixeira Ferreira
  • Eliane Mattos Piranda
  • Fabiana Fonseca Zanoelo
  • Giovana Cristina Giannesi
  • Vagner Ricardo da Silva Fiuza
Resumo Isoobtusilactona A é um butanolídeo extraído do xilopódio de Aiouea trinervis que em estudos anteriores do nosso grupo, demonstrou uma excelente atividade na inibição do crescimento de Trypanosoma cruzi. Outras moléculas, denominadas protolimonóides, extraídos dos frutos de Guarea kunthiana, também foram capazes de reduzir o crescimento parasitário de T. cruzi. Ambos os compostos possuem uma baixa citoxicidade e se tornam uma via alternativa para o tratamento etiológico da Doença de Chagas (DC). A DC é uma Doença Tropical Negligenciada, endêmica na América Latina. Ela atinge, principalmente, as populações mais pobres e ainda não possui cura e muito menos um tratamento adequado, pois, o medicamento utilizado hoje para tratar os pacientes, o benzonidazol, apresenta diversos efeitos adversos e tóxicos para os pacientes, que culminam com a descontinuação do tratamento. Tendo em vista a problemática atual no tratamento da DC e os efeitos promissores da isoobtusilactona A e protolimonóides no retardamento e indução de morte parasitária, o objetivo desse estudo foi avaliar o efeito da associação entre a isoobtusilactona A e os protolimonóides isolados de G. kunthiana, bem como dos protolimonóides entre si, sobre epimastigotas de T. cruzi. Para isso, foi realizado um ensaio de combinação, a fim de testar diferentes proporções das moléculas (a saber, 0:4; 1:3; 1:1; 3:1 e 4:0) sobre a viabilidade celular de epimastigotas de T. cruzi. O Índice de Combinação (IC) das moléculas foi calculado para classificação do efeito segundo Chou (2006) em sinergismo, efeito aditivo ou antagonismo. Como resultado, encontramos que isoobtusilactona A e 3-β-O-tigloilmelianol apresentaram sinergismo (IC = 0,42), com o primeiro diminuindo significativamente a concentração do segundo na combinação (DRI = 5,74). Por outro lado, a combinação entre 3-β-O-tigloilmelianol e 3-β-O-tigloilmelianotriol foi sinérgica apenas na proporção 1:3 da CI90 (IC = 0,89), o efeito final encontrado foi majoritariamente aditivo (IC = 1), porém, com diminuição das concentrações inibitórias de 3-β-O-tigloilmelianol em todas as proporções. Além disso, ambas as combinações, em suas maiores concentrações não foram citotóxicas. As análises de ciclo celular com iodeto de propídeo demonstraram que o tratamento por 24h com as combinações estagnou grande parte dos epimastigotas na fase G1 do ciclo, diminuindo a população nas fases S e G2. Por fim, as análises do efeito das combinações sobre a integridade de membrana mostraram que os compostos não são capazes de romper a integridade da membrana plasmática, porém, a combinação entre isoobtusilactona A e 3-β-O-tigloilmelianol alterou a morfologia parasitária, aumentando o tamanho celular.
Caracterização bioquímica e biológica da peçonha de Tityus confluens
Curso Mestrado em Bioquímica e Biologia Molecular
Tipo Dissertação
Data 20/03/2023
Área BIOLOGIA GERAL
Orientador(es)
  • Malson Neilson de Lucena
Orientando(s)
  • Laís Corrêa de Lima
Banca
  • Alda Maria Teixeira Ferreira
  • Malson Neilson de Lucena
  • Manuela Berto Pucca
  • Monica Cristina Toffoli Kadri
  • Suely Gomes de Figueiredo
Resumo Os escorpiões são artrópodes da ordem Scorpiones, distribuídos em diversos ecossistemas, são animais peçonhentos que apresentam estrutura inoculadora de peçonha, ocasionando acidentes em humanos. Esses acidentes, são considerados um problema de saúde pública em diversos países, como o Brasil, entretanto, apenas 50 espécies das mais de 2700 já descritas, são responsáveis pelos acidentes, e no Brasil todos do gênero Tityus. As peçonhas são misturas complexas, composta de moléculas bioativas, com potencial promissor para a prospecção de novos produtos biotecnológicos e farmacoterápicos. Entretanto, ainda existem poucos estudos a respeito da peçonha de diversos escorpiões como Tityus confluens, que ocorre no cerrado brasileiro. Diante disto, o presente estudo teve como objetivo caracterizar bioquimicamente e biologicamente a peçonha do Tityus confluens. Foi verificado o perfil proteico através de ensaios de eletroforese (SDS-PAGE) e cromatografia, foram investigadas atividades enzimáticas, como fosfolipásica, amilolítica e proteolítica, assim como, o efeito da peçonha sobre a atividade de ATPases de membrana e avaliar a citotoxicidade sobre células normais e tumorais. A peçonha de T. confluens demonstrou um perfil proteico diverso, apresentando bandas de proteínas com massas moleculares entre 50-100 kDa, bandas menores que 10kDapodendo corresponder a peptídeos e, compostos de natureza hidrofílica moderada fracionadas entre 18 – 25 min de tempo de retenção (RT) e o um composto hidrofóbico, de maior abundância, eluido ao 41 min de RT. Em relação a atividade de enzimas de membranas, a peçonha provocou um aumento na atividade de enzimas ATPases quando incubado à 30 e 50 min, referindo se a possibilidade de peptídeos moduladores de canais iônicos, além disso, a demonstrou atividade amilolítica, atividade pouco discutida na composição de peçonhas escorpiônicas. T. confluens não apresentou atividades fosfolipásica e proteolítica, através dos métodos utilizados, e não foi citotóxica contra células normais e neoplásicas. Os resultados obtidos neste estudo contribuem para a caracterização inicial da composição da peçonha de Tityus confluens, possibilitando ampliar a visão a respeito das peçonhas escorpiônicas e do conhecimento acerca de um escorpião amplamente distribuído no estado do Mato Grosso do Sul. Entretanto se faz necessário novos estudos sobre estes compostos, visando moléculas potenciais para a bioprospecção.
"Estudo bioquímico das fitases, proteases e xilanases produzidas por Aspergillus sp e Thermoascus aurantiacus usando fontes de carbono alternativas: comparação com enzimas comerciais e aplicação na alimentação animal
Curso Mestrado em Bioquímica e Biologia Molecular
Tipo Dissertação
Data 17/03/2023
Área BIOLOGIA GERAL
Orientador(es)
  • Giovana Cristina Giannesi
Orientando(s)
  • Ana Lorena de Oliveira Simas
Banca
  • Fabiana Fonseca Zanoelo
  • Giovana Cristina Giannesi
  • Jeandre Augusto dos Santos Jaques
  • Karina Marcia Ribeiro de Souza Nascimento
  • Maria Rita Marques
Resumo Nas últimas décadas a fabricação de ração animal passou a substituir o uso de proteínas de origem animal por fontes de proteína vegetal. Entretanto, muitos ingredientes de origem vegetal contêm fatores antinutricionais como polissacarídeos não amiláceos, fitatos e outros. Desta maneira, são adicionadas enzimas nas rações para aumentar a disponibilidade dos nutrientes dos alimentos, promover o crescimento animal e melhorar o desempenho produtivo zootécnico. Sendo assim, esse estudo foi realizado com o objetivo de selecionar e caracterizar o fungo com melhor produção de fitase, protease e xilanase, aplicar estas enzimas em diferentes alimentos e compará-las com as enzimas comerciais. Foram utilizados sete fungos filamentosos dos gêneros Aspergillus sp e Thermoascus sp em cultivo semi-sólido usando fonte de carbono alternativas. Os melhores produtores de fitase foi A. niveus em arroz integral seguido por Aspergillus sp. M2 em palha de arroz. Os melhores produtores de protease foram Aspergillus sp. M2 em palha de arroz, seguido por A. flavus em farelo de trigo. Em xilanase, os melhores produtores foram A. niveus em arroz integral, seguido por Aspergillus sp. M2 em palha de arroz. O teste de tempo de crescimento mostrou o pico de produção de fitase sendo em A. niveus em 144 horas (3,14 U/mg) de incubação em palha de arroz, assim como para a produção de xilanase com produção máxima de 11,53 U/mg. Já a protease obteve pico em 96 horas com A. niveus (2,67 ± 0,35 U/mg) em palha de arroz. Posteriormente, foi realizada a caracterização enzimática quanto ao pH e temperatura ótima usando A. niveus crescido em palha de arroz. A fitase produzida apresentou um pico de atividade em pH e temperatura de 4,5-5 e 45°C, respectivamente. O pico de temperatura e pH ótimos para as proteases foram 50°C e pH 6, e para as xilanases e 45°C e pH 5, respectivamente. A atividade in vitro nos alimentos para animais foi determinada em µmoles/mL de produto liberado, e a fitase de A. niveus foi melhor em FT (farelo de trigo) com 2,21 ± 0,15 µmoles/mL, já a fitase comercial mostrou melhor atividade em FA (farelo de arroz) com 1,86 ± 0,04 µmoles/mL. A atividade in vitro de protease de A. niveus mostrou maior atividade em FA com 8,34 ± 0,76 µmoles/mL, a protease comercial mostrou melhor resultado no alimento DAF (dieta alternativa - pura fibra) com 5,57 ± 0,14 µmoles/mL. A atividade in vitro da xilanase de A. niveus mostrou altos níveis de atividade enzimática, destacando-se no alimento MI (milho) com 96,55 ± 6,79 µmoles/mL, já xilanase comercial se destacou na degradação de FT com 31,05 ± 3,85 µmoles/mL de açúcar liberado. Desta maneira, foram produzidas enzimas que se adicionadas a alimentos para animais, podem ser capazes de melhorar a disponibilidade de nutrientes em animais não-ruminantes.
TRIAGEM PARA ATIVIDADE ANTICÂNCER E TOXICIDADE DE EXTRATOS DE TRÊS ESPÉCIES DO GÊNERO Campomanesia
Curso Mestrado em Bioquímica e Biologia Molecular
Tipo Dissertação
Data 10/03/2023
Área BIOLOGIA GERAL
Orientador(es)
  • Renata Trentin Perdomo
Orientando(s)
  • Isabela Borges da Mota Silveira
Banca
  • Ana Tereza Gomes Guerrero
  • Claudia Andrea Lima Cardoso
  • Renata Trentin Perdomo
Resumo Plantas do gênero Campomanesia ssp, pertencem a família Myrtaceae, possuindo 36 espécies conhecidas, sendo 31 delas na flora brasileira e são produtoras de substâncias com propriedades biológicas importantes tais como anti-inflamatória, antidiarreica, antimicrobiana e apresentam também atividades antioxidantes. Selecionamos três espécies do gênero Campomanesia ssp, C.adamantium; C. pubescens e C. sessiliflora, mais frequentes no Cerrado do MS, para estudos de toxicidade e atividade anticâncer. Desta forma, realizou-se a triagem da atividade anticâncer e toxicidade de extratos aquosos e etanólicos de folhas das espécies C. adamantium, C. pubescens e C. sessiliflora, usando modelo de cultura celular em monocamada em linhagens neoplásicas humanas e não neoplásicas: 786-0 (adenocarcinoma renal), HEP-G2 (hepatocarcinomma – fígado), HT-29 (adenocarcinoma cólon), MCF-7 (adenocarcinoma de mama), MDA-MB- 231 (adenocarcinoma de mama triplonegativo) e NIH-3T3 (fibroblasto murino), pelo método de sulforrodamina B, e a atividade apoptótica foi avaliada pela marcação com corantes fluorescentes. Foram selecionadas duas linhagens para avaliação de apoptose com brometo de etídio e laranja de acridina (786-0 e MDA-MB-231). O extrato etanólico da C. adamantium apresentou efeito antiproliferativo e estímulo a apoptose na maior concentração testada em ambas as linhagens celulares enquanto o extrato aquoso se mostrou inativo. A espécie C. pubescens apresentou atividade citotóxica contra as células de câncer, com extrato aquoso: 786-0 (69,18 µg/mL), MDA-MB-231 (66,65 µg/mL) e HEPG2 (69,43 µg/mL), sem toxicidade contra as células NIH/3T3 (158,02 µg/mL) , porém sem atividade de estímulo a apoptose para os extratos aquosos e etanólicos. A espécie C. sessiliflora, extrato etanólico, apresentou maior destaque com estímulo a apoptose contra as células de câncer de 786-0 (116,25 µg/mL) e MDA-MB-231 (196,42 µg/mL) apresentando relativa toxicidade frente às células não tumorais. Estes resultados demonstram a heterogeneidade de compostos entre os extratos aquosos e etanólicos e entre as espécies, com indicação de causar dano celular com estímulo de apoptose. As espécies estudadas apresentam potencial para continuidade dos estudos a fim de elucidar a toxicidade a atividade anticâncer.
Palavras-chave: Campomanesia, câncer, citotoxicidade
Produção e Caracterização Bioquímica do complexo amilolítico de Humicola brevis var. thermoidea e sua aplicação na sacarificação do amido
Curso Mestrado em Bioquímica e Biologia Molecular
Tipo Dissertação
Data 03/03/2023
Área BIOLOGIA GERAL
Orientador(es)
  • Douglas Chodi Masui
Orientando(s)
  • Camila Langer Marciano
Banca
  • Douglas Chodi Masui
  • Fabiana Fonseca Zanoelo
  • Giovana Cristina Giannesi
  • Hamilton Cabral
  • Roberto Ruller
Resumo Dentre as enzimas usadas em bioprocessos, as amilases representam um grupo versátil de biocatalizadores usados pela indústria na sacarificação do amido. Isso porque, são enzimas capazes de hidrolisar as ligações glicosídicas do amido e liberar glicose, maltose e cadeias curtas de oligossacarídeos e por isso representam 30% do mercado global de enzimas. Dentre os produtores de amilases, os fungos filamentosos termófilos são microrganismos promissores para aplicações biotecnologicas, pois possuem a capacidade de hidrolisar subprodutos agrícolas e gerar produtos de alto valor agregado através da técnica de fermentação em estado sólido (FES). Em vista disso, foi produzido e caracterizado bioquimicamente o complexo amilolítico do fungo filamentoso termófílo Humicola brevis var. Thermoidea (AmyHb), comparando-o com a amilase comercial Termamyl®, bem como investigado a sua aplicação biotecnológica na sacarificação do amido. Ass im, a produção enzimática foi otimizada em FES, na qual demostrou a maior produção em meio contendo farelo de trigo a 50°C por 5-6 dias, sem adição de indutores. A atividade amilolítica ótima ocorreu em pH 5,0, a 60°C e a enzima se manteve estável entre pH 5,0 a 6,0, com termoestabilidade a 50°C e 60°C, principalmente na presença de Ca2+, resultados melhores do que encontrado pela Termamyl®. Ambas as enzimas foram fortemente inibidas por Hg+2, Cu+2 e Ag+, entretanto a AmyHb aumentou a atividade na presença de Mn+2 e Na+. Além disso, a AmyHb não foi inibida na presença de solventes orgânicos e apresentou uma maior tolerância em uma ampla faixa de NaCl e etanol, tendo um melhor desempenho em hidrolisar amido de batata e maltose quando compara a amilase comercial. A análise do gel de eletroforese mostrou que a AmyHb apresenta uma massa molecular próxima a 48 e 43kDa. Os ensaios de hidrólise de farinha de milho demonstraram que o Coquetel (AmyHb50%+Termamyl®50%) elevou significativamente a liberação de glicose e açúcares redutores totais quando comparados as enzimas sozinhas. A purificação parcial da AmyHb, juntamente com as características observadas pelos experimentos sugerem que o H. brevis produz duas amilases diferentes, mas que apresentam peso molecular muito próximo, o que dificulta a separação e purificação delas. Assim, o complexo amilolítico do H. brevis apresenta propriedades físico-químicas promissoras, com um bom desempenho associado a amilase comercial, o que demonstra ser uma alternativa biotecnológica promissora para aplicação no bioprocessamento de fontes amiláceas.
Produção e Caracterização Bioquímica do complexo amilolítico de Humicola brevis var. thermoidea e sua aplicação na sacarificação do amido
Curso Mestrado em Bioquímica e Biologia Molecular
Tipo Dissertação
Data 03/03/2023
Área BIOLOGIA GERAL
Orientador(es)
    Orientando(s)
      Banca
      • Douglas Chodi Masui
      • Hamilton Cabral
      • Roberto Ruller
      Resumo
      Atividade Citotóxica da Viridicatum toxina A obtida de Penicillium sp. e sua Potencialidade no Tratamento de células Tumorais Humanas
      Curso Mestrado em Bioquímica e Biologia Molecular
      Tipo Dissertação
      Data 03/03/2023
      Área BIOLOGIA GERAL
      Orientador(es)
      • Renata Trentin Perdomo
      Orientando(s)
      • Emylli Areco Pereira
      Banca
      • Ana Camila Micheletti
      • Renata Trentin Perdomo
      • Susana Elisa Moreno
      Resumo As Viridicatum toxinas (VTs) são substâncias produzidas por fungos endofíticos de várias espécies dos gêneros Penicillium, Aspergillus e Paecilomyces. Reconhecida por suas ações antimicrobianas, é considerada um potente antibiótico pertencente à família das tetraciclinas; ambas apresentam um núcleo de carboxamida tetracíclico em sua composição. Além dessa atividade antibiótica, a Viridicatum toxina A (VTA) e seus análogos, Viridicatum toxina B, C, D, E, F, espirohexalina e previridicatumtoxin, apresentaram em estudos anteriores, resultados promissores de citotoxicidade em células neoplásicas de pulmão, cólon e colo de útero in vitro. Neste estudo foram realizados experimentos a fim de verificar a citotoxicidade da Viridicatum toxina A, utilizando o modelo de cultura celular em monocamada. As linhagens de câncer de mama (MCF7), mama triplo-negativo (MDA-MB-231), rim (786-0), fígado (HepG2) e cólon (HT29), foram tratadas nas concentrações de 0,1, 1, 10 e 100 µg/mL e apresentaram resultados de GI50 entre 6,13 e 16,12 µg/mL, com seletividade para todas elas na concentração de 10 µg/mL. Posteriormente duas linhagens de interesse, 786-0 e MDA-MB-231 foram submetidas ao teste com laranja de acridina e brometo de etídeo, nas concentrações da GI50 e 2x GI50, que se aproximavam muito à concentração seletiva, afim de verificar a viabilidade celular, onde ambas as linhagens apresentaram alterações morfológicas que indicaram presença de morte celular pela via de apoptose. O que é reforçado, principalmente por conta de estudos prévios envolvendo a Viridicatum toxina A, que demonstraram a indução de apoptose em células de câncer de colo do útero (HeLa), através da parada da via G2/M, além disso, na linhagem de mama triplo-negativo, as tetraciclinas, quais são estruturalmente semelhantes às VTs, induziram apoptose através da inibição das MMPs (metaloproteinases de matriz). Sendo assim, concluímos através deste, que A VTA é uma substância com potencial para agente antitumoral por apresentar atividade antiproliferativa e citotóxica potente, seletiva na concentração de 10 µg/mL e com indícios de estimular injúria celular pela via de morte celular por apoptose.
      Avaliação da Atividade Anticâncer do Inibidor de Peptidase Inga laurina Trypsin Inhibitor (ILTI)
      Curso Mestrado em Bioquímica e Biologia Molecular
      Tipo Dissertação
      Data 12/04/2022
      Área BIOLOGIA GERAL
      Orientador(es)
      • Maria Ligia Rodrigues Macedo
      Orientando(s)
      • Queisielle Magalhães Carvalho de Souza
      Banca
      • Adilson Beatriz
      • Cicero Rafael Cena da Silva
      • Douglas Chodi Masui
      • Maria Ligia Rodrigues Macedo
      • Teofilo Fernando Mazon Cardoso
      Resumo Inibidores de peptidase da família Kunitz possuem diversos mecanismos de ação anticâncer. O Inga laurina Trypsin inhibitor (ILTI) possui atividade inseticida, fungicida e antibiofilme e foi recentemente produzido por expressão heteróloga com potencial atividade anticâncer in vitro. Entretanto, seu mecanismo de ação anticâncer não foi elucidado. A fim de incrementar os conhecimentos disponíveis sobre a ação anticâncer de inibidores de peptidase vegetais, propomos investigar as propriedades anticâncer do ILTI em modelo de leucemia. Para a obtenção das curvas de citotoxicidade do ILTI, realizou-se o teste de triagem com o sal tetrazólio MTT nas linhagens leucêmicas KG-1, Kasumi e K-562 expostas às concentrações de 0,5 e 5 μM de ILTI por 24 h. Seguiu-se com a avaliação da citotoxicidade com resazurina nas linhagens Raji, CCRF-CEM, KG-1, Kasumi-1 e K-562, expostas as concentrações de 0,1 e 0,5 μM de ILTI, por 24 h. O mecanismo de ação anticâncer do ILTI foi verificado no modelo de leucemia mielóide crônica K-562 por citometria de fluxo. Utilizou-se o ILTI a 0,07 μM, concentração correspondente ao IC50 obtido no ensaio de citotoxicidade com o iodeto de propidio (PI), em 24 h. O tipo de morte celular foi verificado utilizando-se dupla marcação com anexina-V-FITC/PI após 24 h de exposição ao ILTI. Realizou-se também o ensaio de ativação de caspase-3 com o anticorpo PE Rabbit Anti-Active Caspase-3 após 12 e 24 h. O ciclo celular foi analisado utilizando-se marcação com PI, após 24 h. O ILTI foi citotóxico para as linhagens Raji, CCRF-CEM, KG-1, Kasumi-1 e K-562. Células leucêmicas K-562 tratadas com o ILTI sofreram processo de apoptose mediado pela ativação de caspase-3. Aparentemente, apoptose foi a principal via de morte ativada, uma vez que houve um aumento insignificante de morte por necrose. É possível que a apoptose provocada por ILTI possua envolvimento com a parada do ciclo celular na fase G2/M observado em células K-562. Experimentos futuros incluem a ativação de caspase-9, liberação de citocromo C e perda de potencial mitocondrial, para trazer um melhor entendimento da atividade anticâncer do ILTI.
      Palavras-chave: leucemias, leucemia mielóide crônica, inibidores, apoptose.
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      Efeito da peçonha de escorpiões do gênero Tityus sobre a atividade das enzimas do sistema purinérgico em linfócitos e plaquetas de sangue periférico humano.
      Curso Mestrado em Bioquímica e Biologia Molecular
      Tipo Dissertação
      Data 31/03/2022
      Área BIOLOGIA GERAL
      Orientador(es)
      • Malson Neilson de Lucena
      Orientando(s)
      • TELMA RODRIGUES DA SILVA BENETTI
      Banca
      • Alda Maria Teixeira Ferreira
      • Andréia Machado Cardoso
      • Carla Santos de Oliveira
      • Malson Neilson de Lucena
      • Maria Rita Marques
      Resumo O sistema purinérgico é um sistema de sinalização, no qual os nucleotídeos de purina, ATP (Adenosina 5′-trifosfato) e ADP (Adenosina difosfato), e o nucleosídeo, adenosina, atuam como mensageiros extracelulares. CD39 (ecto-nucleosídeo trifosfato difosfohidrolase 1, E-NTPDase1) converte ATP em ADP e ADP em AMP, e então CD73 (ecto-5'-nucleotidase, Ecto5'NTase) desfosforila AMP em adenosina. CD39 e CD73 regulam a função de vários tipos de células imunológicas, incluindo linfócitos. Além disso, há evidências de que alterações na expressão e atividade de CD39 afetam o potencial trombogênico dos tecidos. O objetivo deste estudo foi quantificar a atividade enzimática da CD39 e CD73 na presença de peçonha de escorpiões Tityus confluens (Tc) e Tityus paraguayensis (Tp), em amostras de linfócitos e plaquetas humanos. Nossos resultados demonstram que a peçonha de T.c tem efeito supressor sobre atividade da CD39 na hidrólise de ATP em linfócitos do sangue periférico quando comparados ao controle (P<0,05). Por outro lado nossos resultados demonstram não haver efeito sobre as enzimas CD39 e CD73 em plaquetas do sangue periférico. Este estudo traz pela primeira vez o efeito da peçonha de escorpiões Tityus sobre as enzimas CD39 e CD73 em células do sangue periférico. Futuros estudos, com maiores doses, poderão elucidar a via de ação principal das peçonhas quando em contato com o sangue.
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      AVALIAÇÃO DO EFEITO ANTIMICROBIANO E ANTIBIOFILME DE UM INIBIDOR DE PEPTIDASE DE Inga cylindrica
      Curso Mestrado em Bioquímica e Biologia Molecular
      Tipo Dissertação
      Data 31/03/2022
      Área BIOLOGIA GERAL
      Orientador(es)
      • Maria Ligia Rodrigues Macedo
      Orientando(s)
      • Ana Paula Ramos Pereira
      Banca
      • Caio Fernando Ramalho de Oliveira
      • Carolina Turatti Oliveira
      • Fabiana Fonseca Zanoelo
      • Maria Ligia Rodrigues Macedo
      • Rita de Cassia Avellaneda Guimaraes
      Resumo A descoberta dos antibióticos revolucionou o controle das infecções. Entretanto, a história dos antibióticos e o desenvolvimento de resistência microbiana caminham lado a lado. Com isso, a busca por novos antimicrobianos se iniciou. Nas últimas décadas, os antimicrobianos oriundos de espécies vegetais vêm se destacando. Os inibidores de enzimáticos vegetais podem desestabilizar patógenos por meio de danos à membrana e/ou parede celular e alteração da permeabilidade celular. Este trabalho teve por objetivo avaliar o potencial antimicrobiano e antibiofilme do inibidor de tripsina de sementes de Inga cylindrica, investigar seu mecanismo de ação frente a leveduras patogênicas, bem como sua toxicidade em Galleria mellonella. Após o isolamento, a concentração inibitória mínima (CIM), concentração fungicida mínima (CFM) e a atividade antibiofilme foram avaliadas. Também foram analisados os efeitos sinérgicos do ICTI em associação a anfotericina B e a toxicidade do ICTI frente a G. mellonella. O ICTI é uma proteína constituída por uma única cadeia polipeptídica de aproximadamente 20 kDa. A atividade inibitória do ICTI foi específica para a tripsina. O ICTI não possui atividade bactericida, mas apresenta ação fungicida. ICTI apresentou CIM de 32,11 μM para C. albicans 90028 e C. gattii AFLP4. A combinação de ICTI com anfotericina B apresentou efeito sinérgico. A CIM do ICTI inibiu a formação do biofilme de C. albicans 90028 e C. gattii AFLP4, em 38,5% e 21,5%, respectivamente. A CIM de ICTI também promoveu a erradicação de formas maduras de biofilme de C. albicans 90028 e C. gattii AFLP4, 37,2% e 22,1, respectivamente. Com base nos resultados obtidos, sugerimos que a atividade antifúngica do ICTI envolva a ligação ao ergosterol presente na membrana celular fúngica. Essa ação específica também é observada nos antifúngicos poliênicos, como a anfotericina B. Dada a capacidade do ICTI se ligar ao ergosterol, danos na membrana ocorrem, promovendo o extravasamento do conteúdo intracelular, como demonstrado pelos resultados deste trabalho. Por fim, o ICTI não se mostrou tóxico quando administrado no modelo G. mellonella, o que suporta ensaios futuros em outros modelos animais.
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      Avaliação do potencial antimicrobiano dos extratos proteicos das sementes de Inga laurina (Fabaceae) e sua aplicação em uma preparação farmacêutica
      Curso Mestrado em Bioquímica e Biologia Molecular
      Tipo Dissertação
      Data 29/03/2022
      Área BIOLOGIA GERAL
      Orientador(es)
      • Maria Ligia Rodrigues Macedo
      Orientando(s)
      • Bruna Sanae Moroto
      Banca
      • Ana Cristina Jacobowski
      • Douglas Chodi Masui
      • Eduardo Benedetti Parisotto
      • Maria Ligia Rodrigues Macedo
      • Teofilo Fernando Mazon Cardoso
      Resumo A investigação de moléculas de origem vegetal com potencial atividade antimicrobiana tem ganhado cada vez mais relevância na prevenção e tratamento de diferentes enfermidades. O inibidor de tripsina de Inga laurina (ILTI), presente nas sementes dessa espécie, apresenta estabilidade sob ampla faixa de pH e temperatura. O objetivo desse estudo foi avaliar a atividade antimicrobiana e antibiofilme do extrato obtido das sementes de I. laurina (EBS), investigar os potenciais mecanismos de ação associados e incorporar, pela primeira vez, o EBS em nanopartículas mesoporosas de sílica (SiO2NPs) para comparar a atividade antimicrobiana na ausência e presença do nanocarreador, bem como desenvolver e avaliar a atividade antimicrobiana de uma preparação tópica semissólida contendo o extrato. Frutos maduros de I. laurina foram coletados e as sementes foram separadas da polpa. Após desidratadas e trituradas, a farinha das sementes foi extraída com tampão fosfato de potássio 0,1 M + NaCl 0,15 M, pH 7,6, a 25°C, por 2 h, sob agitação magnética. Após a centrifugação, o sobrenadante foi denominado EBS. A atividade antimicrobiana foi determinada in vitro pelo método de microdiluição em caldo, por meio da determinação dos valores de concentração inibitória mínima (CIM). Para avaliar a toxicidade aguda do EBS, utilizou-se o modelo invertebrado de Galleria mellonella. Diferentes preparações semissólidas na concentração de 1% (p/p) de EBS foram produzidas e a atividade antimicrobiana foi testada in vitro pelo método de difusão em ágar frente a Candida albicans. O controle foi feito com o creme comercial Nistatina. Diferentes concentrações de EBS na preparação (1, 5, 10, 15 e 20%) foram testadas. Após a seleção da melhor concentração, realizou-se o estudo de estabilidade acelerado em temperatura controlada de 40°C ± 2°C durante intervalos selecionados até 30 dias, em que se analisou as características de homogeneidade, odor, cor, pH e atividade microbiológica. O EBS foi ativo na concentração de 4 mg/mL, apresentando especificidade contra fungos e não inibindo o crescimento bacteriano. A menor CIM foi reportada para C. gattii, (31,25 µg/mL) e contra diferentes espécies de Candida, a CIM variou entre 250 e 1000 µg/mL. No ensaio com G. mellonella, o EBS não demonstrou toxicidade nas doses testadas. Após a síntese das SiO2NPs, cerca de 50,34% do EBS foi incorporado às nanopartículas, por meio da análise termogravimétrica. No entanto, as nanopartículas incorporadas ao EBS não apresentaram atividade antimicrobiana. Dentre as preparações, a que apresentou melhor atividade foi o gel base de Carbopol-940 incorporado ao extrato. Houve um aumento significativo (p<0,05) na atividade antifúngica do gel na concentração de 5% (p/p) de EBS. Acima dessa concentração, não houve aumento significativo na atividade antifúngica. No estudo de estabilidade acelerado, a preparação do gel a 5% apresentou halo de inibição de 14,66 ± 1,22 mm no tempo zero, sendo maior que o halo do controle. Porém, ao longo do estudo, houve perda da atividade após 21 dias. As características de pH, odor e homogeneidade não se alteraram significativamente ao final de 30 dias. Este é o primeiro estudo que propõe o desenvolvimento de uma preparação semissólida contendo o extrato das sementes de I. laurina e, além de não tóxico, o extrato possui potencial aplicação tecnológica no tratamento de infecções tópicas associadas a Candida, instigando estudos futuros que avaliem a reformulação da base semissólida a fim de prolongar sua atividade na preparação.
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        DESENHO DE UM NOVO PEPTÍDEO ANTIMICROBIANO ULTRACURTO GUIADO POR FERRAMENTAS COMPUTACIONAIS
        Curso Mestrado em Bioquímica e Biologia Molecular
        Tipo Dissertação
        Data 28/03/2022
        Área BIOLOGIA GERAL
        Orientador(es)
        • Maria Ligia Rodrigues Macedo
        Orientando(s)
        • MARIA CAROLINE DE MOURA CAVALHEIRO
        Banca
        • Caio Fernando Ramalho de Oliveira
        • Fabiana Fonseca Zanoelo
        • Malson Neilson de Lucena
        • Maria Ligia Rodrigues Macedo
        • Marlon Henrique e Silva Cardoso
        Resumo Os peptídeos antimicrobianos possuem sítios de ação diferente dos antibióticos convencionais. Pesquisas recentes têm buscado por peptídeos capazes de controlar bactérias multirresistentes, sem apresentar efeitos colaterais contra células saudáveis. Neste trabalho descrevemos as propriedades antimicrobianas do RK8, um peptídeo ultracurto, que possui 8 resíduos de aminoácidos. As características físico-químicas do RK8 foram projetadas previamente através de ferramentas computacionais. A estrutura secundária de RK8 foi determinada na presença de água e condições que mimetizam as membranas biológicas por dicroísmo circular (CD). O peptídeo foi testado contra cepas de bactérias multirresistentes Gram-negativas e Gram-positivas. O efeito sinérgico de RK8 e ciprofloxacino foi avaliado contra Escherichia coli KPC+ e Acinetobacter baumannii multirresistente. A capacidade de erradicar biofilmes maduros multirresistentes de A. baumannii também foi avaliada. Ensaios de citotoxicidade in vitro e in vivo foram realizados. A estabilidade do RK8 contra peptidases foi investigada ‘em solução de soro fetal bovino a 25% e seu mecanismo de ação sobre a membrana microbiana avaliada através da a captação do intercalante de DNA Sytox green. Análises de CD mostraram que o RK8 assumiu uma estrutura não-ordenada em água e dodecil sulfato de sódio (SDS), sugerindo que mesmo sendo originalmente desenhado para assumir uma estrutura secundária do tipo alfa-hélice, devido ao seu tamanho reduzido, o peptídeo atua sobre membranas com uma estrutura estendida. O peptídeo apresentou uma concentração inibitória mínima (CIM) contra MRSA ATCC33591 e ATCC43300 de 8 e 16 µM, respectivamente. Para E. coli KPC+ e A. baumannii, RK8 apresentou uma CIM de 16 e 64 µM, respectivamente. A combinação de RK8 e o ciprofloxacino apresentou efeito sinérgico contra E. coli KPC+, reduzindo em 32 vezes e 8 vezes a concentração do antibiótico e do peptídeo, respectivamente, para exercer efeitos antimicrobianos. O RK8 foi capaz de erradicar 38% do biofilme maduro de A. baumannii, quando utilizado na CIM ou na metade dela, afetando a estrutura do biofilme e a viabilidade bacteriana. O RK8 não apresentou efeitos citotóxicos contra macrófagos murinos (até 64 µM) ou contra eritrócitos (até 100 µM) ou contra larvas de Galleria mellanella (até 960 µM). No ensaio de estabilidade contra peptidases, o RK8 se mostrou estável, mantendo cerca de 60% da molécula íntegra após 120 min de incubação. Neste mesmo tempo de ensaio, o reagente Sytox Green alcançou 100% de permeação de membrana de bactérias Gram-positivas e Gram-negativas. Em resumo, RK8 representa uma estratégia promissora para o desenvolvimento de um novo agente antimicrobiano e antibiofilme contra bactérias multirresistentes.
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          Estudo de reposicionamento de fármacos com potencial atividade contra enzimas do metabolismo de Trypanosoma cruzi
          Curso Mestrado em Bioquímica e Biologia Molecular
          Tipo Dissertação
          Data 25/03/2022
          Área BIOLOGIA GERAL
          Orientador(es)
          • Alda Maria Teixeira Ferreira
          Orientando(s)
          • Caroline Silva Garcia
          Banca
          • Alda Maria Teixeira Ferreira
          • Carla Cardozo Pinto de Arruda
          • Carla Leticia Gediel Rivero Wendt
          • Malson Neilson de Lucena
          • Renata Trentin Perdomo
          Resumo Trypanosoma cruzi, é o agente etiológico da doença de Chagas, uma das principais doenças de saúde pública de interesse na América Latina. Os fármacos disponíveis para o tratamento dessa doença (benznidazol e nifurtimox) apresentam maior eficácia na fase aguda, porém são relatados inúmeros casos de efeitos adversos. Nesse panorama, o reposicionamento de fármacos tem se tornado uma estratégia importante por ser uma alternativa mais rápida e menos onerosa do que a descoberta e o desenvolvimento de novos fármacos. Este trabalho teve como objetivo a seleção in silico de fármacos já aprovados para uso clínico em humanos com potencial atividade contra T. cruzi cepa Dm28.Foram utilizadas bases de dados on-line e gratuitas para a busca e seleção de drogas com potencial ação sobre enzimas homólogas dos metabolismos energético e lipídico do T. cruzi, com base na identificação de alvos de drogas com alta similaridade aos genes de patógenos. Na base de dados TDR Targets foram identificados 139 e 151 genes codificadores de enzimas do metabolismo energético e do metabolismo lipídico de T. cruzi, respectivamente. Posteriormente, obteve-se a sequência aminoacídica das enzimas citadas na base de dados TriTrypDB. As sequências foram inseridas nos bancos de dados DrugBank e no Therapeutic Targets para identificação de alvos de drogas homólogos. Dentre as sequências proteicas com resultados positivos, foram incluídas somente aquelas com E-value<1e-10. As sequências incluídas apresentaram correspondência com 265 fármacos para o metabolismo energético e 387 para o lipídico. Dessas, 56 e 42, respectivamente, eram drogas já aprovadas para o uso em humanos. Em seguida, foi realizada a seleção dos fármacos cuja atividade anti-T. cruzi Dm28c não havia sido previamente reportada, utilizando os bancos de dados PUBMED, LILACS e Google Acadêmico, resultando em 19 fármacos para o metabolismo energético e 25 para o lipídico. Dos 44 fármacos identificados no estudo como potenciais agentes anti-T. cruzi, 7 foram submetidos a testes in vitro. Dentre os fármacos testados, o nitrato de oxiconazol e o lansoprazol se mostraram ativos contra formas epimastigotas de T. cruzi, entretanto, apenas o segundo teve atividade contra formas tripomastigotas do parasito. Além disso, a estratégia in silico de reposicionamento de fármacos utilizada neste trabalho elencou mais 37 fármacos, ainda não submetidos a testes in vitro, com potencial ação anti-T. cruzi.

          Palavras-chave: Doença de Chagas, Trypanosoma cruzi, Reposicionamento de Fármacos, In Silico
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            Caracterização bioquímica e biológica da peçonha e hemolinfa de Tityus paraguayensis
            Curso Mestrado em Bioquímica e Biologia Molecular
            Tipo Dissertação
            Data 03/03/2022
            Área BIOLOGIA GERAL
            Orientador(es)
            • Malson Neilson de Lucena
            Orientando(s)
            • Henrique Ranieri Covali Pontes
            Banca
            • Fabiana Fonseca Zanoelo
            • Ludovico Migliolo
            • Malson Neilson de Lucena
            • Monica Cristina Toffoli Kadri
            • Renata dos Santos Rodrigues
            Resumo Os escorpiões são artrópodes pertencentes a ordem Scorpiones, com aproximadamente 2654 espécies descritas e distribuídas por diversos ecossistemas, sendo muitas destas endêmicas. Estes animais apresentam hemolinfa e glândulas de peçonha, contendo a peçonha que pode ser inoculada na presa pelo télson. Portanto, os escorpiões são animais peçonhentos, embora cerca de 50 espécies apresentem importância médica. Tanto a hemolinfa, quanto a peçonha apresentam componentes com diversas funções bioquímicas e biológicas, entre essas algumas de interesse farmacológico e/ou biotecnológico. Visto isso, o presente estudo teve como objetivo caracterizar bioquímica e biologicamente a peçonha e hemolinfa do escorpião endêmico de Mato Grosso do Sul, T. paraguayensis. Para este fim, foram realizadas as seguintes etapas: ensaios eletroforéticos; atividades proteolíticas, fosfolipásicas A2, lipolíticas e antitríptica; atividade antitripanossômica; avaliação da citotoxicidade; efeito da peçonha e hemolinfa sobre a atividade (Na+,K+)-ATPase; e obtenção de perfil cromatográfico. Observou-se nos ensaios eletroforéticos e cromatográficos que a peçonha apresenta uma grande diversidade de componentes, também se detectou atividade proteolítica, fosfolipásica e lipolítica, ademais a peçonha provocou um aumento de atividade da enzima (Na+,K+)-ATPase e uma diminuição da viabilidade de formas epimastigota de T. cruzi. Não foram observadas citotoxicidade contra células normais e atividade antitríptica da peçonha de T. paraguayensis. A hemolinfa por sua vez, apresentou baixa diversidade de proteínas, além da presença de atividades proteolítica e lipolítica. Os resultados demonstram que a peçonha e hemolinfa de T. paraguayensis apresentam potencial para bioprospecção de compostos de interesse farmacológico e/ou biotecnológicos, necessitando de novos estudos para caracterizar e isolar estes componentes.
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            ATIVIDADES BACTERICIDAS E ANTICANCERÍGENAS DO INIBIDOR DE TRIPSINA PURIFICADO DE SEMENTES DE Enterolobium timbouva
            Curso Mestrado em Bioquímica e Biologia Molecular
            Tipo Dissertação
            Data 20/12/2021
            Área BIOLOGIA GERAL
            Orientador(es)
            • Maria Ligia Rodrigues Macedo
            Orientando(s)
            • PAULA BÊLIT MAZACOTE ZENTENO
            Banca
            • Eduardo Benedetti Parisotto
            • Fabiana Fonseca Zanoelo
            • Josy Goldoni Lazarini
            • Maria Ligia Rodrigues Macedo
            • Rita de Cassia Avellaneda Guimaraes
            Resumo Um dos problemas enfrentados mundialmente é a resistência microbiana. Nesse contexto, inibidores de peptidases vegetais que têm potencial atividade antimicrobianos e também podem servir como modelo para o desenho de novos fármacos, capazes de induzir morte. Nesse trabalho objetivou-se isolar e purificar um inibidor de tripsina das sementes de Enterolobium timbouva (EtTI), além de verificar suas atividades bactericidas e antitumorais. O EtTI foi purificado em duas etapas cromatográficas. A eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) com dodecil- sulfato de sódio (SDS) revelou que EtTI possui um peso molecular aproximado de 19 kDa. O EtTI apresentou concentração inibitória mínima (CIM) para espécies de bactérias Gram-positivas: Staphylococcus epidermidis (9µM), Staphylococcus haemolyticus (9µM) e Staphylococcus saprophyticus (4.5µM) e Gram-negativa: Escherichia coli (9µM). Ao fazer o tratamento com CIM e 10 vezes o valor de CIM obtivemos os resultados para biofilmes: redução na formação do biofilme e no biofilme maduro para a cepa S. saprophyticus. Imagens representativas de ensaio com biofilme, foram obtidas por microscopia de fluorescência. No ensaio com Sytox Green - permeável em células com membranas danificadas – tivemos uma permeação 48% em 2 horas, indicando possível mecanismo por dano de membrana. Além disso, EtTI mostrou efeito sinérgico com o antibiótico Vancomicina. Na avaliação de atividade anticâncer, o inibidor apresentou um IC50 de 2,69µM em células de melanoma murino. Em teste in vivo, através de modelo invertebrado Galleria mellonela, EtTI não apresentou toxicidade aguda nas concentrações estudadas. A atividade biológica de EtTI demostra potencial antimicrobiano e, a partir da elucidação da sequência do EtTI, peptídeos antimicrobianos podem ser desenhados a fim de se obter potenciais moléculas com aplicação clínica.
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              PERFIL DE CITOCINAS EM PACIENTES COM CERVICITE, LESÕES CERVICAIS OU CARCINOMA CERVICAL
              Curso Mestrado em Bioquímica e Biologia Molecular
              Tipo Dissertação
              Data 09/12/2021
              Área BIOLOGIA GERAL
              Orientador(es)
              • Ines Aparecida Tozetti
              Orientando(s)
              • Mariana Mayumi Tadokoro
              Banca
              • Alda Maria Teixeira Ferreira
              • GISELE FACHOLI BOMFIM
              • Ines Aparecida Tozetti
              • Luana Silva Soares
              • Marco Antonio Moreira Puga
              Resumo O Papilomavírus humano (HPV) é um agente infeccioso que tem a capacidade
              de induzir infecções crônicas sem repercussão sistêmica, e isso ocorre por vários
              motivos, como: ser exclusivamente intraepitelial, não promover inflamação ou lise
              celular, causar pouca ou nenhuma viremia, de certa forma, não ativando precocemente
              os mecanismos de alerta do sistema imune inato. É sabido que devido aos mecanismos
              pelos quais as células infectadas pelo HPV escapam da vigilância imunológica,
              incluindo a diminuição e ou alteração do perfil de citocinas, a persistência da infecção
              viral poderá ocorrer e assim culminar em alterações celulares tais como Lesão
              intraepitelial escamosa de alto grau (HSIL) e Carcinoma cervical (CC). O estudo sobre
              perfis de citocinas é de extrema relevância para melhor entendimento sobre a infecção
              por HPV e a resposta imune do hospedeiro fornecendo assim uma compreensão mais
              elucidativa sobre citocinas como biomarcadores, possibilitando a busca por novos
              fármacos, estratégias de diagnósticos e tratamentos. O objetivo deste estudo foi
              detectar o perfil de citocinas em pacientes com cervicite, lesões cervicais ou
              carcinoma cervical. Foi realizada para tanto, uma pesquisa descritiva, observacional de
              corte transversal envolvendo pacientes atendidas no Hospital de Amor, unidade de
              Campo Grande – MS no durante o ano de 2019 e 2020, onde selecionou-se pacientes
              submetidas à citologia cervical, biopsia do colo uterino e pesquisa de HPV de alto
              risco oncogênico (HR-HPV) pelo método Cobas® HPV Test. Foram incluídas no
              estudo 66 pacientes do com idade entre 25 a 65 anos (média de 42,29 anos). A análise
              de citocinas em pacientes com cervicite, lesões cervicais ou carcinoma cervical
              demonstrou que a IL-6 está em maior concentração em pacientes positivas para
              HPV16 que em relação a pacientes que positivaram para outros tipos de HR-HPV
              (p<0,05). A IL-17 esteve presente em maior concentração em pacientes com cervicite,
              HSIL e carcinoma, também em pacientes HPV negativos, embora estes resultados não
              tenham sido significativos.
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              Produção, purificação, caracterização e avaliação do potencial biotecnológico da endo-xilanase do fungo termofílo Humicola brevis var. thermoidea
              Curso Mestrado em Bioquímica e Biologia Molecular
              Tipo Dissertação
              Data 10/06/2021
              Área BIOLOGIA GERAL
              Orientador(es)
              • Douglas Chodi Masui
              Orientando(s)
              • ALINE PEREIRA DE ALMEIDA
              Banca
              • Douglas Chodi Masui
              • Fabiana Fonseca Zanoelo
              • MARIA DE LOURDES TEIXEIRA DE MORAES POLIZELI
              • Roberto Ruller
              Resumo A biodegradação da biomassa lignocelulósica, particularmente da hemicelulose, depende de um grupo de enzimas denominado de complexo hemicelulolítico, produzidas principalmente por fungos e bactérias. Dentre estas hemicelulases, as endo-xilanases têm sido amplamente utilizadas com objetivo de se valorizar a hemicelulose na aplicação em bioprocessos. Neste contexto, o objetivo deste trabalho foi produzir, purificar, caracterizar e avaliar o potencial biotecnológico da endo-xilanase de Humicola brevis var. thermoidea na sacarificação da biomassa lignocelulósica. Com este intuito, a partir do coquetel enzimático obtido através de fermentação em estado sólido, a endo-xilanase nativa (XylHb) foi purificada. A caracterização biofísica das estruturas secundárias por dicroísmo circular indicaram a predominância de folhas β, uma característica típica de endo-xilanases da família GH11 e a análise da fluorescência intrínseca dos Trp indicaram que a proteína tem o seu enovelamento terciário com os resíduos de Trp imersos em um ambiente hidrofóbico. Os resultados das caracterizações bioquímicas e cinéticas da XylHb indicaram que a enzima apresentou uma maior tolerância em uma ampla faixa de pH, temperatura, NaCl e etanol, tendo um melhor desempenho em hidrolisar a xilana birchwood em temperaturas de 50 e 60 ºC quando compara a xilanase comercial (Cellic®HTec2). Os ensaios de hidrólise do bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado hidrotérmicamente demonstraram que a suplementação de Cellic®CTec2 com XylHb apresentaram interações sinérgicas e elevaram significativamente a liberação de glicose e açúcares redutores totais quando comparados ao padrão comercial Cellic®Ctec2 individual. Assim, a XylHb purificada do extrato enzimático de H. brevis var. thermoidea por apresentar propriedades físico-químicas potenciais, performances e sinergismo com celulase comercial, que são características importantes para a aplicação em ambiente industrial, poderá contribuir como uma alternativa biotecnológica promissora para aplicação e valorização da hemicelulose na produção de bioprodutos.
              Purificação, caracterização bioquímica e imobilização de uma β-glucosidase de Rasamsonia composticola
              Curso Mestrado em Bioquímica e Biologia Molecular
              Tipo Dissertação
              Data 28/05/2021
              Área BIOLOGIA GERAL
              Orientador(es)
              • Fabiana Fonseca Zanoelo
              Orientando(s)
              • Isabela Pavão Vargas
              Banca
              • Douglas Chodi Masui
              • Fabiana Fonseca Zanoelo
              • Giovana Cristina Giannesi
              • Roberto Ruller
              • Rodrigo Simões Rodrigues
              Resumo As β-glucosidases são enzimas que fazem parte do complexo celulolítico com a capacidade de atuar sobre materiais lignocelulósicos promovendo sua hidrólise. Essas enzimas são produzidas por microrganismos, principalmente os fungos filamentosos. Possuem variadas aplicações como na indústria de papel e celulose, alimentícia, ração animal e na produção de etanol de segunda geração. O presente trabalho descreve a purificação, características bioquímicas e imobilização de uma β-glucosidase produzida pelo fungo termofílico Rasamsonia composticola. A enzima foi purificada utilizando duas etapas cromatográficas, incluindo a troca iônica DEAE-Fractogel e hidrofóbica Phenyl-Sepharose. Foi purificada 19 vezes com rendimento final de 14%. A β-glucosidase purificada apresentou temperatura ótima de 70°C, permanecendo estável em temperaturas de 65 a 70°C durante até 8 horas, pH 5,0, e uma massa molecular de aproximadamente 45 kDa. A enzima não foi estimulada pela maioria dos compostos químicos testados, entretanto foi levemente estimulada pelos detergentes saponina e triton X-100, além dos quelantes EDTA e EGTA e o agente redutor Temed. A enzima apresentou atividade sobre os substratos sintéticos pNP-Glc e pNP-Xyl, e demonstrou ser tolerante a glicose e estimulada por xilose (1-100 mM). Os parâmetros cinéticos estimados para a β-glucosidase foram de Km e Vmax de 2,3 mM e 0,0221 µmol/min/mg para pNP-Glc. A eficiência catalítica (Kcat/Km) da enzima foi de 7,7x10-11. Para pNP-Glc + glicose e pNP-Glc + xilose a enzima apresentou Km e Vmax de 2,33 mM e 0,0271 µmol/min/mg e 2,02 mM e 0,0255 µmol/min/mg, respectivamente. A enzima foi imobilizada em glioxil agarose cerca de 40% e 56% na presença de glicose durante 60 minutos. Demonstrou atividade ótima em pH 5,0 e 75°C. A enzima imobilizada apresentou estabilidade nas temperaturas de 75 a 80°C durante 60 minutos de reação. Os resultados demonstram que o fungo Rasamsonia composticola pode ser um candidato a contribuir para o conhecimento das propriedades de uma β-glucosidase com grande potencial de aplicação biotecnológica.
              Efeito de Diaril Dissulfetos sobre Trypanosoma cruzi
              Curso Mestrado em Bioquímica e Biologia Molecular
              Tipo Dissertação
              Data 10/03/2021
              Área BIOLOGIA GERAL
              Orientador(es)
              • Alda Maria Teixeira Ferreira
              Orientando(s)
              • Bruna Migliorini Melo Silva
              Banca
              • Alda Maria Teixeira Ferreira
              • Alessandra Gutierrez de Oliveira
              • Edson dos Anjos dos Santos
              • Fabiana Fonseca Zanoelo
              • Malson Neilson de Lucena
              Resumo Trypanosoma cruzi é um protozoário flagelado, considerado o agente etiológico da
              doença de Chagas. No Brasil, estima-se que mais de três milhões de pessoas sofrem com esta
              moléstia e que apesar dos investimentos em saneamento básico e ações preventivas para o seu
              controle, este ainda é um problema sério de saúde, afetando as pessoas mais pobres, que
              vivem em áreas rurais e com baixas condições de moradia. Os medicamentos atualmente
              utilizados são pouco eficazes na fase crônica da doença e apresentam uma série de efeitos
              colaterais. Algumas classes de compostos orgânicos representam alternativas potenciais para
              o desenvolvimento de novos fármacos. É o caso da classe dos dissulfetos de diarila, cujos
              compostos apresentam propriedades interessantes que vêm sendo exploradas em diversas
              áreas da química sintética, farmacêutica e também na produção de polímeros. Sendo assim,
              este trabalho teve como objetivo a avaliação de cinco compostos sintéticos dessa classe
              quanto à atividade sobre formas epimastigotas de T. cruzi. A metodologia utilizada envolveu
              ensaios biológicos para avaliação da viabilidade metabólica e do crescimento dos parasitas,
              além de ensaio de citotoxicidade em células Vero. Com base nos resultados foi observado que
              todos os compostos possuem atividade biológica sobre formas epimastigotas de T.cruzi. Os
              compostos A e D foram os mais ativos no tratamento in vitro durante 72h, apresentando
              valores de CI50 de 3,5µM e 3,7µM, respectivamente. No entanto, após o tratamento dos
              parasitos por 24h, os compostos mais ativos foram o D e E, com valores de CL50 de 0,7µM e
              0,9µM, respectivamente. Quanto à avaliação de citotoxicidade sobre células Vero, os
              compostos A, C e E apresentaram os maiores valores de CC50 (34,1µM; 32,0µM e 30,5µM,
              respectivamente), enquanto o composto D mostrou ser o mais citotóxico dentre os cinco
              testados. Na curva de recuperação, todos os compostos foram capazes de inibir o crescimento
              dos parasitas em até 96h após a retirada da droga. Observou-se também que o alvo de ação no
              parasito depende, provavelmente, da posição do ligante em relação à ligação dissulfeto na
              estrutura dos compostos. Tais resultados indicam a ação dos compostos dissulfetos de diarila
              sobre mecanismos que influenciam na proliferação celular de T.cruzi, revelando dados
              promissores para futuras pesquisas.
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